Компактный квантовых точек для одиночных молекул изображений

Общая цель этой процедуры заключается в получении флуоресцентных квантовых точек с оптимизированной яркостью и стабильностью, а также минимальным размером и неспецифической связью для использования в визуализации одиночных молекул. Это достигается путем предварительной подготовки небольших ядер квантовых точек на основе селенида кадмия. Второй шаг заключается в сплаве этих ядер с ртутью, чтобы сместить их флуоресценцию в красный спектр и увеличить их яркость.

Затем на нанокристаллах выращивается тонкая оболочка из сплава для стабилизации их флуоресцентного излучения. Заключительным этапом является перенос этих частиц из органических растворителей в водные буферы с помощью полимера с несколькими зубцами, который может быть модифицирован биологически инертным полиэтиленгликолем. В конечном счете, флуоресцентная спектрометрия, гель-хроматография и гель-электрофорез используются, чтобы показать, что эти частицы обладают яркой флуоресценцией, компактным гидродинамическим размером и нейтральным электростатическим зарядом, хорошо подходящими для флуоресцентной визуализации одиночных молекул в биологии.

Основное преимущество этих квантовых точек перед существующими коммерческими материалами заключается в том, что эти наночастицы имеют значительно меньший гидродинамический размер. Несмотря на то, что на квантовые точки меньшего размера негативно влияют снижение интенсивности флуоресценции, снижение стабильности флуоресценции и флуоресценция только в синем спектре, мы компенсировали эти эффекты с помощью процесса катионного обмена ртути. Эти нанокристаллы могут помочь ответить на ключевые вопросы биофизики и клеточной сигнализации, обеспечивая динамическую визуализацию отдельных биомолекул в переполненных биологических средах.

Для начала приготовьте сверху 0,4 молярного раствора селена, добавив селен на 50 миллилитров. Колба с тремя горлышками, опорожнение колбы под высоким вакуумом и заполнение аргоном с помощью хвостовика sch в условиях отсутствия воздуха. Добавьте 10 миллилитров верхушки и нагрейте до 100 градусов Цельсия, помешивая в течение часа, чтобы получить прозрачный бесцветный раствор.

Остудите раствор до комнатной температуры и отставьте колбу в сторону. Также приготовьте раствор оксида кадмия TDPA и ОДУ в колбе объемом 250 миллилитров с тремя горлышками, используя количества, указанные в письменном протоколе. В соответствии с этим видео, откачайте раствор с помощью хвостовика во время перемешивания.

Увеличьте температуру до 100 градусов по Цельсию и отокачивайтесь еще на 15 минут. Чтобы удалить примеси с низкой температурой кипения под аргоннским газом, нагрейте смесь до 300 градусов Цельсия в течение одного часа для полного растворения оксида кадмия. Раствор изменится с красноватого цвета на прозрачный и бесцветный, охладите раствор до комнатной температуры.

Далее добавьте в раствор кадмия HDA, нагрейте до 70 градусов Цельсия и вакуумируйте. Как только будет достигнуто постоянное давление, увеличьте температуру и обеспечьте раствор обратным потоком в течение 30 минут. Переключите линейный клапан Schlink на инертный газ и вставьте термопару непосредственно в раствор.

В условиях отсутствия воздуха добавьте DPP в раствор кадмия и увеличьте температуру до 310 градусов Цельсия. Теперь с помощью одноразового пластикового шприца, прикрепленного к игле 16 калибра, удалите 7,5 миллилитров 0,4 молярного раствора селена. Как только температура уравновесится до 310 градусов Цельсия, установите регулятор температуры на ноль градусов Цельсия и быстро введите верхний раствор селена непосредственно в раствор кадмия.

Раствор будет меняться с бесцветного на желтый, оранжевый, а температура быстро понизится и снова повысится примерно до 280 градусов по Цельсию. Самым сложным этапом в этой процедуре является максимально быстрое введение в раствор кадмия всего объема шприца. Это обеспечивает однородное зарождение частиц.

После одной минуты реакции снимите колбу с нагревательной мантии и быстро охладите потоком воздуха до тех пор, пока температура не станет меньше 200 градусов по Цельсию. Когда температура достигнет примерно 40 градусов по Цельсию, разведите с 30 миллилитрами гексана, большая часть оставшегося предшественника кадмия осядет из раствора. Удалите этот осадок центрифугированием.

В каждой из шести полипропиленовых конических пробирок по 50 миллилитров разведите по 12 миллилитров полученного сырого нанокристаллического раствора. С 40 миллилитрами ацетона после центрифугирования с теми же параметрами осторожно сцедите надосадочную жидкость и выбросьте надосадочную жидкость. Затем растворите гранулы нанокристалла в гексане.

Экстрагируйте раствор с равным объемом метанола, сохраняя верхнюю фазу. Повторите это извлечение еще дважды для третьего извлечения. Объем метанола может быть скорректирован примерно до 15 миллилитров для получения концентрированного гексанового раствора чистых квантовых точек селенида кадмия при соотношении примерно 200 микромоляров.

Типичный выход этой реакции составляет три микромолярных кристалла селенида кадмия диаметром два три нанометра определяют диаметр нанокристалла и концентрацию путем измерения ультрафиолетового видимого спектра поглощения, как описано в письменной методике, нанокристаллы могут быть частично обменены ртутью на красное смещение, поглощение и излучение флуоресценции. Для этого в стеклянный флакон объемом 20 миллилитров с мешалкой смешайте гексан и хлороформ, затем добавьте в него раствор селенида кадмия квантовых точек OLA и октановое число ртути виолат. После очистки нанокристаллов и определения их концентрации, как описано в письменной процедуре, дайте нанокристаллам состариться не менее 24 часов при комнатной температуре для роста оболочки.

Приготовьте 0,1 раствора предшественника молярной оболочки в 50 миллилитрах, три горлышки в вакуумных тепловых растворах предшественника кадмия, предшественника цинка и предшественника серы для обратного воздействия в течение одного часа до получения прозрачных растворов, затем зарядите аргоном в колбу с тремя горлышками. Добавьте топо ОДУ и подготовленные квантовые точки с селенидом ртути и кадмия. Откачайте гексин при комнатной температуре, используя боковую линию.

Увеличьте температуру до 100 градусов по Цельсию и восстановите в течение 15 минут. Замените линейный клапан на Аргоннский газ и вставьте термопару в раствор nano Krystal. После повышения температуры до 120 градусов Цельсия добавьте 0,5 монослоя или 140 микролитров раствора прекурсора серы и дайте протекать реакции в течение 15 минут.

Увеличьте температуру до 140 градусов по Цельсию. Добавьте 0,5 монослоя или 140 микролитров раствора предшественника кадмия и дайте протекать реакции в течение 15 минут. Затем добавьте в реакционный раствор 500 микролитров безводного OLA

Добавьте 160 градусов Цельсия, добавьте 0,5 монослоя или 220 микролитров раствора предшественника серы, а затем равное количество раствора предшественника цинка при температуре 170 градусов Цельсия с 15 минутами между каждым добавлением. Затем при температуре 180 градусов Цельсия добавьте 0,25 монослоя, или 150 микролитров раствора предшественника серы и раствора предшественника цинка с интервалом в 15 минут. Классно. Решение проблемы комнатной температуры и новый коэффициент экстинкции для этих частиц.

Используя УФ-видимый спектр, предполагая, что количество нанокристаллов не изменилось, храните реакционный раствор в виде сырой смеси в морозильной камере. На этом этапе нанокристаллы могут быть охарактеризованы с помощью электронной микроскопии, абсорбционной спектроскопии в ультрафиолетовом диапазоне и флуоресцентной спектроскопии. Добавьте квантовые точки очищенного ядра в 50-миллилитровую колбу с тремя горлышками и удалите гексин под высоким вакуумом.

Чтобы получилась сухая пленка, наполните колбу аргонной. Добавьте безводный пурин в пленку наночастиц и нагрейте суспензию до 80 градусов Цельсия в течение одного-двух часов. Наночастицы полностью растворятся.

Добавьте в раствор один миллилитр одного FIO-глицерина и размешивайте при температуре 80 градусов Цельсия в течение двух часов. После остывания раствора до комнатной температуры добавьте 0,5 миллилитров триэтиламина, чтобы депротонировать тиоглицерин, и перемешивайте в течение 30 минут. После добавления триэтиламина раствор может помутнеть из-за плохой растворимости полярных нанокристаллов в этой смеси растворителей.

Перелейте раствор квантовой точки в коническую центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров, содержащую смесь из 20 миллилитров гексана и 20 миллилитров ацетона, и хорошо перемешайте. Выделите осажденные нанокристаллы с помощью центрифугирования, затем промойте гранулы ацетоном, растворите гранулу квантовой точки в пяти миллилитрах ДМСО с помощью ультразвуковой обработки в ванне и затем центрифугируйте. Чтобы удалить возможные агрегаты, затем определите концентрацию наночастиц по спектру поглощения УФ-V.

Раствор чистых квантовых точек следует использовать в течение трех часов, так как поверхность может медленно окисляться в условиях окружающей среды на воздухе. Разбавьте раствор квантовых точек до 10 микромоляров или менее с помощью ДМСО и переложите в колбу объемом 50 миллилитров. Добавьте приготовленный раствор расширенной полиакриловой кислоты объемом пять миллиграммов на миллилитр в ДМСО, по капле к раствору квантовых точек при помешивании и дегазируйте раствор при комнатной температуре в течение пяти минут.

Продуйте полимерный раствор квантовой точки с помощью Аргонны и нагрейте до 80 градусов Цельсия в течение 90 минут. Остыв раствор до комнатной температуры, добавьте равный объем 50 миллимоляров натрия с pH восемь по каплям и перемешайте в течение 10 минут. Очистите квантовые точки, как описано в письменной процедуре, и определите концентрацию по спектру поглощения в четырехмиллилитровом стеклянном флаконе с мешалкой, смешайте одну молярную квантовую точку в боратном буфере с 40 000-кратным молярным превышением 750 моноаминополиэтиленгликоля Дальтона.

Инструкции можно найти в письменной методике о том, как придать нанокристаллам определенную химическую функциональность. Быстро добавьте в раствор квантовых точек в 25 000 раз молярный избыток свежеприготовленного раствора активирующего агента и перемешайте его при комнатной температуре в течение 30 минут. Повторите этот шаг еще четыре раза, чтобы насытить поверхность нанокристалла ПЭГ.

Наконец, добавьте 200 микролитров одного молярного трис-буфера, чтобы погасить реакцию перед очисткой нанокристаллов Используя диализные центробежные фильтры или ультрацентрифугирование, полученный нанокристалл можно проанализировать на монодисперсность, гидродинамический размер и поверхностный заряд с помощью жидкостной хроматографии, гель-электрофореза и флуоресцентной микроскопии. Здесь представлены репрезентативные спектры поглощения и флуоресценции для нанокристаллов селенида кадмия, ртути, кадмия, селенида, нанокристаллов после обмена кадионов, а также ядра нанокристаллов селенида кадмия ртути, кадмия в оболочке, нанокристаллов сульфида цинка после роста оболочки. Нанокристаллы селенида кадмия имеют квантовый выход флуоресценции около 15%, однако эта эффективность падает до менее чем 1% после обмена ртути, вероятно, из-за ловушек носителей заряда, введенных в результате разрушения поверхностных атомов.

Рост тонкой оболочки из сульфида кадмия и цинка повышает эту эффективность до более чем 70%, которая в значительной степени сохраняется после переноса в воду. Напротив, ядро селенида кадмия, оболочка кадмия, нанокристаллы сульфида цинка без включения ртути теряют значительную долю своего количественного выхода в воде, если не выращивать толстую оболочку. Важно отметить, что укупорка сульфидом кадмия и цинка смещает спектры в красную сторону из-за утечки электронных носителей заряда в материал оболочки.

Этот сдвиг составляет от 20 до 30 нанометров для кернов из кадмия и увеличивается с увеличением содержания ртути в ядре. Таким образом, путем включения ртути в ядро нанокристалла, можно сохранить небольшой размер нанокристалла без ущерба для яркости. На этой просвечивающей электронной микрофотографии демонстрируется малый размер и распределение частиц по размерам нанокристаллов ртути, кадмия, селенида, оболочки кадмия, сульфида цинка, показывающие средний диаметр 3,2 плюс-минус 0,6 нанометров.

Использование двухступенчатого фазового переноса в воду имеет решающее значение для получения однородной популяции нанокристаллов, которые не требуют дальнейшей сортировки по размерам для удаления кластеров и исключения размеров агрегатов. Хроматограмма, изображенная здесь, подтверждает, что размер альбумина аналогичен размеру альбумина. При 75 килодальтонах и после модификации 750 дальтонами аминоПЭГ размер увеличивается до 12 нанометров, аналогично размеру антитела IgG.

Модификация ПЭГ нейтрализует поверхностный заряд, что подтверждено в эксперименте с гелевым электрофорезом aros, изображенном здесь, лунка отмечена стрелкой, а полярность электродов указана справа, показывая, что перед конъюгацией нанокристаллы мигрируют в виде звуковых частиц и что пегилированные нанокристаллы являются электростатически нейтральными. Здесь показана эпифлуоресцентная микрофотография этих нанокристаллов, нанесенных на стеклянную крышку и возбуждаемых видимым светом с яркостью 545 нанометров. Эти нанокристаллы легко наблюдать на уровне одной молекулы со скоростью 30 кадров в секунду с помощью ПЗС-камеры, умножающей электроны.

Этот график показывает, что количество флуоресцентных частиц, наблюдаемых в каждом кадре, колеблется со временем при непрерывном возбуждении. Это происходит из-за сочетания моргания и деградации фотографий. Мигание доминирует в течение первых семи минут, прежде чем окислительная деградация фотографий постепенно становится очевидной.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как химически синтезировать квантовые точки, как переносить их в водные буферы и как модифицировать их для применения в биовизуализации. Не забывайте, что работа с реагентами, содержащими кадий и ртуть, может быть чрезвычайно опасной, поэтому следует принять дополнительные меры предосторожности для предотвращения личного воздействия.