Двух-и трехмерных изображений живых клеток ДНК, белков реакции на повреждения

В этой демонстрации используется двух- и 3D-визуализация живых клеток для понимания пространственно-временных отношений белков, участвующих в реакции на повреждение ДНК. Во-первых, трансфектируйте или трансдуцируйте выбранную вами клеточную линию с помощью конструктов экспрессии, содержащих соответствующие флуоресцентные маркеры. Здесь М. Черри и GFP получают серию контрольных видеороликов, показывающих флуоресцентно меченые клетки в нормальных условиях.

Затем примените соответствующую обработку и получите данные о влиянии лечения на процесс флуоресцентных клеток и проанализируйте видеоданные на предмет пространственно-временных отношений белков. В конечном счете, флуоресцентная микроскопия живых клеток может детализировать клеточную динамику, такую как образование очагов 53 BP one в ответ на агенты, повреждающие ДНК, или поведение 53 BP one во время митоза. Впервые мы заинтересовались двумя и 3D-визуализацией образа жизни, когда захотели изучить, как различные методы лечения влияют на митоз в определенных клеточных линиях.

Этот экспериментальный подход позволяет нам изучать реакцию на повреждение ДНК и поддержание стабильности генома легче, чем традиционные методы. Кроме того, вы можете использовать этот метод для изучения того, как определенные белки взаимодействуют в различных сигнальных путях и различных клеточных линиях. Основное преимущество визуализации образа жизни по сравнению с традиционными методами, такими как химия цитотерапии, заключается в том, что она позволяет изучать белки ответа на повреждение ДНК в режиме реального времени.

Оптимизация правильных условий записи может быть сложной задачей. С помощью этой демонстрации можно увидеть множество маленьких шагов, необходимых для достижения успеха. Помните, что настойчивость окупается, когда речь идет о минимизации обесцвечивания фотографий, поиске правильных интервалов записи и правильной продолжительности записи и так далее.

Трансфектируйте или трансдуцируйте соответствующие клеточные линии с плазмидами для экспрессии гибридных белков mCherry и GFP. Сохраняйте культуры в процессе отбора лекарственных препаратов и периодически проверяйте экспрессию флуоресцентных белков за день до получения изображения. Соберите клетки с помощью трипсина.

Затем высейте культуры низкой плотности на 3,5-сантиметровые стеклянные дно фторсодержащей чашки. Этот протокол был разработан с использованием конфокального микроскопа Zeiss Cell Observer SD, оснащенного аксио-наблюдателем Z один стенд Сначала убедитесь, что газ CO2 поступает к модулю CO2 инкубационной системы. Если микроскоп опирается на антивибрационный Airtable, то включите подачу воздуха для Airtable.

Теперь включите питание для микроскопа, стенда, вращающегося диска, камеры, инкубационные модули, осветитель HXP, моторизованный стол, аргоннский лазер и компьютер. Включите переключатели для используемых лазерных линий. Запустите программное обеспечение машинного зрения Axio.

Программное обеспечение Avision может быть настроено с помощью окон и выпадающих меню, специфичных для микроскопа и компонентов, которыми он управляет. Таким образом, каждый пользовательский интерфейс имеет потенциально уникальный внешний вид примерно за час до создания образа. Найдите органы управления инкубатором и включите подогрев верхней камеры и тарелки сцены.

Установите температуру на 37 градусов по Цельсию. Включите контроль CO2 и установите уровень на 5%Выберите линзу объектива для визуализации В этом исследовании. Для линзы объектива необходимо использовать иммерсионную среду, которая имеет показатель преломления, аналогичный воде.

Если вам нужно визуализировать несколько положений в течение длительных периодов времени, обязательно нанесите достаточное количество иммерсионной среды, чтобы эндоскоп не высох. Поставьте чашку для культуры на сцену и поднесите линзу объектива к дну с помощью микроскопа или программного обеспечения. Направьте излучаемый свет на окуляры и выберите подходящий набор широкоугольных фильтров для интересующего флуоресцентного сигнала.

Теперь смотрите через окулярные линзы. Сфокусируйте изображение и найдите подходящее поле клеток с помощью программного обеспечения или микроскопа. Направьте излучаемый свет от окуляров в порт с помощью конфокального вращающегося диска в программном обеспечении.

Включите соответствующий лазер для данного исследования. Для каждого канала отрегулируйте интенсивность лазера, отрегулировав управление оптическим фильтром kuo до соответствующего уровня. Далее подбираем подходящее дихроичное зеркало и фильтры излучения.

Откройте заслонку к вращающемуся дисковому блоку. Теперь выберите окно реального времени, чтобы отобразить текущее поле зрения. Теперь откройте окно управления камерой.

Выберите камеру, которую вы будете использовать, и установите время экспозиции примерно 100 миллисекунд. При необходимости отрегулируйте процентное и электромагнитное усиление. Кроме того, откройте элемент управления для конфокального вращающегося диска и отрегулируйте скорость вращающегося диска, введя время экспозиции камеры, которое было установлено для захвата подходящего изображения.

Нажмите «Установить», чтобы зафиксировать изменение. Теперь откройте окно многомерного сбора данных. Выберите вкладку канала и загрузите или выберите соответствующие каналы, определенные для Flora Fours.

Чтобы обеспечить регистрацию изображения, используйте общее дихроичное зеркало для обоих каналов. Установите программное обеспечение в режим автоматической фокусировки. Перейдите в окно MDA и перейдите на вкладку ZS stack

Выберите стек ZS в текущем положении фокусировки. Установите диапазон для Зака 10 микрон и выберите оптимальное количество шагов для обеспечения выборки Найквиста через Z. Теперь нажмите «Пуск» и проанализируйте полученное изображение стека Z. Выберите вкладку времени.

Установите интервал между временными точками визуализации и общую продолжительность сеанса. Для многоточечной визуализации нескольких клеток в чашке откройте окно MDA. Выберите вкладку позиции и убедитесь, что установлен флажок Применить до или после временной точки для каждой позиции.

Теперь выберите пометку. Находите с помощью живого просмотра, перемещайте тарелку и выбирайте соответствующие поля зрения. Нажмите кнопку «Пуск» в меню многомерного сбора данных, чтобы начать эксперимент и записать управляющее видео.

Добавьте соответствующее лечение и запишите экспериментальное видео через определенные промежутки времени в течение определенного периода времени. Для этой клеточной линии и для мониторинга всего процесса митоза мы использовали интервал в семь с половиной минут, и он составлял четыре-пять часов. Вам нужно будет определить конкретные настройки для вашей клеточной линии и для того, что вы хотите изучать.

Откройте программу velocity, создайте и назовите новую библиотеку и импортируйте экспериментальные видеофайлы для просмотра файлов. Попробуйте использовать расширенную настройку фокусировки, при необходимости корректируйте видео. Velocity оснащена рядом инструментов, которые помогут улучшить качество получаемых изображений.

Если настройки на микроскопе соответствующие, это сэкономит много времени в дальнейшем при редактировании. Часто бывает полезно делегировать изображения и регулировать яркость и контрастность, ваши конкретные потребности будут варьироваться в зависимости от вашего эксперимента. Переключитесь на настройку непрозрачности 3D.

Это позволяет вращать 3D-визуализированные клетки в пространстве, тем самым обеспечивая множественные перспективы представляющих интерес структур внутри клеток. Кино. Неподвижные изображения можно экспортировать в различные типы файлов в зависимости от предпочтений пользователя по сравнению с элементами управления. Клетки фибробластов, подвергшиеся воздействию CPT, образовывали очаги в течение 5-10 минут и поддерживали эти очаги на протяжении всей записи.

Интересно, что в эмбриональных клетках почек человека 53 BP 1 диссоциирует от хроматина в начале митоза, образуя тонкую дымку вокруг конденсирующихся хромосом. По мере того, как происходит телеф и заканчивается митоз 53 б.н., один, вновь агрегируется в отдельные очаги. Мы надеемся, что это видео позволит вам изучить пространственно-временные отношения белков, участвующих в ответе на повреждение ДНК, а также других путях.

Например, в области динамики хроматина эта методика была использована для изучения того, как связывание 53 BP one влияет на движение теломерных концов ДНК. После создания генетически модифицированных клеток двух- и 3D-визуализация живых клеток может быть выполнена примерно за четыре-восемь часов. Убедитесь, что настройки микроскопа отрегулированы соответствующим образом для получения оптимального изображения.