Опытные образцы для оптимизации STORM супер-разрешения микроскопии

Общая цель данной процедуры — продемонстрировать способ получения высококачественных изображений сверхвысокого разрешения методом STORM. Для этого сначала подготавливают тестовый образец с флуоресцентной меткой. На втором этапе готовят переключающий буфер, после чего заполняют им измерительную камеру.

Затем на микроскопе STORM регистрируются исходные данные. Заключительным этапом является реконструкция изображений сверхвысокого разрешения из исходных данных с помощью программного обеспечения Rainstorm. В конечном итоге тестовые образцы используются для демонстрации того, как получить высококачественные исходные данные, которые затем могут быть обработаны для создания STORM-изображений клеток со сверхвысоким разрешением от 30 до 50 нанометров, что представляет собой пяти- или десятикратное повышение разрешения по сравнению с традиционными методами флуоресцентной микроскопии, включая TIRF и конфокальную микроскопию.

Как правило, специалисты, впервые применяющие данный метод, сталкиваются с трудностями, так как не осознают важности сбора большого количества высококачественных разреженных связей. Это значительно упрощается при использовании красителя Alexa 647 в соответствующем буфере для переключения. Визуальная демонстрация данной методики крайне важна, поскольку получение высококачественных необработанных данных имеет решающее значение для создания изображений с разрешением SPR.

Необработанные видеопоследовательности, полученные с помощью данного метода, выглядят совершенно иначе, чем при любом другом виде флуоресцентной микроскопии. Чтобы начать процедуру покрытия стекла флуоресцентным декстрином, внесите по 200 µL 0,01% раствора полилизина в каждую лунку восьмикамерного предметного стекла и инкубируйте в течение 10 минут. По истечении 10 минут удалите раствор полилизина с помощью пипетки, чтобы убедиться в отсутствии остатков жидкости.

0.25 µL стокового раствора декстрина Alexa 647 в концентрации 2 mg/mL добавьте в 25 µL деионизированной воды, чтобы приготовить раствор с концентрацией 20 µg/mL для создания покрытия из раствора декстрина Alexa 647 высокой плотности.

Разведите 20 µL раствора с концентрацией 20 µg/mL в деионизированной воде до общего объема 200 µL. Для получения раствора средней плотности разведите 2 µL в 200 µL деионизированной воды. Для получения раствора низкой плотности разведите 0,2 µL.

В 200 µL деионизированной воды добавьте по 200 µL разведенного раствора декстрина Alexis X 47 в каждую лунку и инкубируйте в течение 10 минут. Можно использовать более длительное время инкубации, что может привести к образованию более плотного слоя декстрина. В завершение удалите растворы Dexter Xis X 47 и трижды промойте водой.

Для предварительной подготовки флуоресцентных актиновых филаментов на стекле добавьте по 200 µL 0,01% раствора полилизина в каждую лунку восьмилуночного планшета. Накройте покровным стеклом и инкубируйте в течение 10 минут. Удалите раствор пипеткой, убедившись, что жидкость полностью удалена.

В каждую камеру добавьте 90 µL общего буфера для актина, предварительно приготовленного в соответствии с инструкциями производителя. Затем добавьте 10 µL раствора предварительно сформированных актиновых филаментов с концентрацией 10 µM и 1 µL Alexa 647, осторожно перемешайте содержимое путем постепенного всасывания и вытеснения жидкости пипеткой; инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре. Для подготовки флуоресцентных микросфер в качестве реперных маркеров разведите 1 µL бусин Tepec в 200 µL PBS и перемешайте. Добавьте разведенные бусины в камеру для визуализации и подождите 15 минут.

Через 15 минут удалите раствор и трижды промойте клетки PBS перед проведением визуализации. В данном эксперименте используются клетки, выращенные до достижения примерно 80% конфлюэнтности. Удалите культуральную среду и промойте клетки PBS. Затем добавьте 500 µL 4% раствора формальдегида на 10 минут.

Удалите формальдегид и трижды промойте клетки раствором PBS. Не допускайте высыхания клеток и всегда используйте буферные растворы PBS. Чтобы избежать гипотонического стресса, добавьте 2 µL стокового раствора EGF Alexa 647 в концентрации 50 µg/mL к 200 µL 0,1% раствора BSA, а затем добавьте полученный раствор к клеткам HeLa.

Инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре. Удалите раствор и трижды промойте PBS. Добавьте блокирующий раствор, содержащий 0,1% BSA, и оставьте на 15 минут при комнатной температуре.

После этого удалите блокирующий раствор и промойте образец еще трижды с помощью PBS перед проведением визуализации. Непосредственно перед визуализацией приготовьте переключающий буфер, смешав стоковые растворы фермента глюкозооксидазы и восстановителя в соотношении 50 µL, 400 µL и 100 µL; добавьте PBS до достижения конечного объема 1 mL. Удалите PBS из камеры визуализации, а затем заполните ее переключающим буфером доверху.

Осторожно накройте камеру покровным стеклом, убедившись в полном отсутствии пузырьков воздуха и том, что вся поверхность камеры закрыта. При обнаружении пузырьков воздуха долейте дополнительный буфер или PBS. В противном случае эффективность буфера может снизиться.

Для успешного выполнения данной процедуры крайне важно собрать высококачественные разреженные данные о связях, поэтому убедитесь, что микроскопы правильно сфокусированы и используются корректные настройки сбора данных. Найдите флуоресцентную структуру, которую необходимо визуализировать. Выберите желаемый угол освещения.

В данном случае рекомендуется использовать объектив с функцией TIRF (полного внутреннего отражения) или под большим углом наклона, так как это повышает отношение сигнал/шум за счет минимизации расфокусированного света, что особенно полезно для образцов клеток. Сделайте референсный снимок структуры с ограниченным числом фракций перед началом STORM-визуализации. Увеличьте мощность возбуждающего лазера до высокого значения, соответствующего примерно 2 kW/cm², при настройках камеры: время экспозиции 10 ms и частота цикла приблизительно 50 Hz или кадров в секунду.

Когда флуорофоры перейдут в режим редкого мерцания, соберите 10 000 кадров. Для начала реконструкции откройте файл RAINSTORM M в MATLAB и запустите его в окне rainstorm.

Выберите файл изображения для анализа с помощью кнопки обзора. Файл должен быть в формате TIF. Измените ширину пикселя, чтобы она соответствовала необработанным данным системы микроскопии, использованной для получения данных.

Оставьте остальные значения по умолчанию. Нажмите кнопку process images и дождитесь появления предварительного изображения. Продолжительность обработки будет зависеть от размера файла, технических характеристик компьютера и количества потенциальных связей в необработанных данных.

Для создания обновленного изображения сверхвысокого разрешения нажмите кнопку open reviewer, после чего откроется второе окно. Нажмите кнопку adjust contrast, чтобы изменить отображение изображения в соответствии с вашими пожеланиями. В некоторых случаях, когда изображение слишком темное, максимальное значение следует уменьшить.

Используйте окно рецензента для получения полезных показателей качества изображения и дальнейшего уточнения изображения сверхвысокого разрешения. Оставьте первые три параметра контроля качества по умолчанию: 5 000, 0,1 и от 0,8 до 3,5 соответственно. Обновите значение количества отсчетов на фотон.

Измените порог точности локализации, чтобы сбалансировать оптимизацию среднего значения локализации и точности с количеством локализаций. Для итогового изображения рекомендуются значения от 30 до 50 nanometers в зависимости от качества данных и образца. По умолчанию коэффициент масштабирования реконструкции равен пяти, что при размере пикселя в исходных изображениях 160 nanometers обеспечит получение пикселей сверхразрешения размером 32 nanometers.

Если размер пикселя на исходных изображениях составляет 100 нанометров, результатом будут изображения сверхвысокого разрешения с пикселями по 20 нанометров. Увеличьте коэффициент масштабирования, чтобы получить пиксели сверхвысокого разрешения меньшего размера. В окне итогового изображения нажмите кнопку запуска рецензента (run reviewer), чтобы сгенерировать обновленное изображение сверхвысокого разрешения.

Нажмите кнопку просмотра гистограмм, чтобы отобразить метрики качества изображения. В завершение нажмите кнопку сохранения изображения в окне просмотра, чтобы сохранить все эти данные. Начните выполнение данной процедуры с получения изображения аналогичным способом, который был продемонстрирован ранее.

Нажмите кнопку отслеживания области в окне рецензирования, затем выделите рамкой фидуциальный маркер на просматриваемом изображении. Дождитесь появления нового изображения, на котором будут отображены положения выделенных областей. При необходимости сохраните это изображение, если объектом исследования является фидуциальный маркер.

Как и в данном случае, выполните коррекцию дрейфа, нажав кнопку set anchor, а затем кнопку subtract drift. Наконец, снова нажмите run reviewer, чтобы создать новое изображение STORM. При успешном нанесении декстрина должен образоваться флуоресцентный монослой; типичные данные для декстрина представлены на этом рисунке.

На изображениях с дифракционным пределом показаны различные концентрации декстрина перед визуализацией методом STORM. Суперразрешающие реконструкции имеют размер пикселя 25 nanometers. Было собрано 10 000 изображений с размером кадра 128 на 128 пикселей; на данной последовательности представлены отдельные кадры.

При высокой концентрации декстрина флуоресцентный монослой должен выглядеть относительно однородным, как показано на этих изображениях и в данном видеофрагменте. При более низких концентрациях вспышки будут выглядеть более редкими и четкими.

При отсутствии явного фонового сигнала на данном этапе сбора изображений при постоянном лазерном освещении число мерцаний будет уменьшаться со временем, что проиллюстрировано сравнением кадра 2000 и кадра 8 000 для образца с высокой плотностью. Основное различие между изображениями сверхвысокого разрешения для высокой, средней и низкой концентраций декстрина заключается в уменьшении количества локализаций. На этом графике показано среднее значение трех последовательностей по 10 000 кадров для каждой концентрации декстрина, где планки погрешностей обозначают стандартное отклонение.

Однако эта пропорциональная зависимость между концентрацией флуоресцентных молекул, числом мерцаний в исходных данных и количеством локализаций не является простой линейной, что наглядно показано на данном графике количества принятых локализаций на кадр. При использовании скользящего среднего за 100 кадров при очень высокой плотности молекул программное обеспечение не может успешно локализовать молекулы при визуализации любого образца. Распространенной проблемой может быть наличие яркого, но расфокусированного флуоресцентного тумана по всему изображению, вызванного диффузией флуорофоров через среду.

Отсоединение этих флуоресцентных молекул можно предотвратить или их можно удалить, увеличив количество этапов промывки PBS перед добавлением переключающего буфера или путем добавления свежего переключающего буфера в камеру; обработка и сравнение данных из каждой последовательности изображений приводят к получению существенно различающихся изображений сверхвысокого разрешения. Панели C и D представляют собой реконструкции изображений сверхвысокого разрешения, соответствующие данным, собранным на панелях A и B соответственно. На этом графике показано количество принятых локализаций на кадр с использованием скользящего среднего по 100 кадрам.

Красная линия соответствует последовательностям STORM A и C с высоким уровнем фона, синяя линия — B и D с низким уровнем фона. Принятое количество локализаций для изображений, соответствующих данным с высоким и низким уровнем фона, показано на втором графике. Эти три изображения с дифракционным пределом демонстрируют типичные данные по предварительно сформированным актиновым филаментам, прикрепившимся к поверхности стекла перед добавлением переключающего буфера и проведением STORM-визуализации.

Наблюдаются филаменты различной длины. Очень яркие филаменты часто представляют собой несколько перепутанных между собой нитей. Выбор одиночных относительно ярких филаментов вместо перепутанных участков позволяет получить изображения более высокого качества на этапе сбора данных.

Вдоль всей длины филамента должны наблюдаться яркие точечные вспышки. Редкое мерцание должно быть заметно на этапе сбора данных и, соответственно, в обработанных данных. Должен присутствовать тонкий непрерывный филамент, а количество локализаций на кадр должно постепенно снижаться.

Обычно ширина на полувысоте (FWHM) филамента приводится в качестве эмпирической оценки разрешения; для этого с помощью функции профиля графика в ImageJ проводится прямая линия через увеличенный участок актинового филамента с последующим гауссовым аппроксимированием. Значение FWHM составляет 43.2 nanometers. Чтобы избежать проблем с неправильной локализацией в случаях, когда несколько актиновых филаментов разветвляются или пересекаются, следует обработать подмножества кадров и сравнить первые и последние 5, 000 кадров.

При использовании первых 5 000 кадров получается другое изображение сверхвысокого разрешения. В центре изображения наблюдается множество локализаций. Однако при использовании последних 5 000 кадров лишь немногие из этих локализаций заметны, и остаются только филаменты, хотя они выглядят менее непрерывными из-за малого количества локализаций на изображении.

Если есть подозрение на слишком высокую плотность мерцания, сравнение изображений с данными локализации за кадр может убедительно указать на то, что эта проблема возникает во время первой серии кадров. Среднее количество локализаций на кадр превышает 10, по сравнению с последней серией кадров, где оно составляет примерно четыре. Другой потенциальной проблемой в микроскопии STORM является дрифт, который возникает при смещении образца относительно объектива. Хотя дрифт очень трудно обнаружить в процессе получения изображений, его можно выявить на изображениях сверхвысокого разрешения известных структур, таких как актиновые филаменты.

Первым признаком возможного бокового дрифта является то, что структура оказывается больше, чем ожидалось. Например, когда ширина на полувысоте относительно велика по сравнению с пределом точности данных при «ливне» (rainstorm), в данном случае 90 nanometers по сравнению с 67 nanometers. Более эффективным способом обнаружения дрифта является сравнение локализаций в зависимости от времени, то есть проверка того, смещены ли локализации на более поздних кадрах по сравнению с локализациями на ранних кадрах.

Это отчетливо видно на примере актиновых филаментов при использовании цветового кодирования. При использовании функции отслеживания боксов в rainstorm, как показано на панелях B и C, локализации отображаются цветом, соответствующим номеру кадра, в котором они были зафиксированы. Например, локализации, полученные в начале последовательности сбора данных, окрашены в синий цвет, в то время как локализации из конца последовательности — в красный.

Смещенные цвета указывают на возникновение дрейфа, который необходимо измерить и скорректировать. В качестве реперных меток для измерения дрейфа могут использоваться флуоресцентные микросферы диаметром 100 nanometer; на изображениях с первого по четвертое представлены отдельные обрезанные и увеличенные микросферы. В примере с относительно сильным дрейфом (примерно 100 nanometers за три минуты 10 seconds фазы сбора данных) функцию отслеживания по рамке можно использовать для цветового кодирования и подтверждения дрейфа. Поскольку все четыре микросферы в данном примере демонстрируют почти идентичный дрейф, можно выбрать одну из них (в данном случае микросферу два) в качестве эталона и вычесть величину этого дрейфа из показателей остальных микросфер.

Сравнение с панелью E показывает, что боковой дрейф был скорректирован. Наконец, клетки HeLa, окрашенные на эпидермальный фактор роста, могут быть использованы для наглядного примера разрешения изображения. На панели A представлено дифракционно-ограниченное изображение части клетки HeLa с фокусировкой на базальной поверхности клетки, где желтыми рамками отмечены увеличенные области интереса, показанные на панелях B и C, в отличие от нечетких увеличенных областей интереса на дифракционно-ограниченном изображении.

На изображениях сверхвысокого разрешения должна быть видна смесь кластеров и редких изолированных одиночных пикселей. Кластеры будут иметь диаметр примерно 100 nanometers и, вероятно, будут соответствовать формирующимся порам и везикулам. Путь, по которому EGF преимущественно подвергается даунрегуляции и эндоцитозу, а также данные о локализациях за кадр из панели D представлены на графике G. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создавать простые тестовые образцы, собирать данные и реконструировать высококачественные изображения сверхвысокого разрешения STORM.

Эти методы помогут избежать некоторых распространенных проблем при подгонке данных, таких как дрейф, и помогут оптимизировать вашу систему STORM. См. эксперименты по определению разрешения.