Опытные образцы для оптимизации STORM супер-разрешения микроскопии

Общая цель этой процедуры — продемонстрировать, как получить высококачественные изображения шторма со сверхвысоким разрешением. Это достигается путем предварительной подготовки тестового образца с флуоресцентной меткой. Вторым шагом является подготовка коммутационного буфера и последующее заполнение им камеры визуализации.

Затем необработанные данные собираются на штормовом микроскопе. Последним шагом является реконструкция изображений со сверхвысоким разрешением на основе необработанных данных с помощью программного обеспечения для обработки ливней. В конечном счете, тестовые образцы используются для демонстрации того, как получать высококачественные исходные данные, которые затем могут быть обработаны для создания изображений сверхвысокого разрешения в ячейках с разрешением от 30 до 50 нанометров, что представляет собой увеличение разрешения в пять-десять раз по сравнению с традиционными методами флуоресцентной микроскопии, включая газонные и конфокальные.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что они не осознают важность сбора большого количества высококачественных разреженных ссылок. Это значительно упрощается при использовании красителя Alexa 6 4 7 в правильном буфере переключения. Визуальная демонстрация этого метода имеет важное значение, поскольку получение высококачественных исходных данных имеет решающее значение для получения изображений с разрешением SPR.

Необработанные видеопоследовательности этого метода выглядят совершенно иначе, чем при любой другой форме флуоресцентной микроскопии. Начать процедуру покрытия стекла флуоресцентным декстрином в дозе 200 мкл 0,01%-ного раствора полилизина в каждую лунку с восьмикамерной крышкой стекла и выдерживать в течение 10 минут. Через 10 минут удалите раствор полилизина с помощью пипетки, чтобы убедиться, что жидкости не осталось разбавленной.

0,25 микролитра двухмиллиграммового на миллилитр стокового раствора декстрина. Alexa 6 47 в 25 микролитров деионизированной воды для создания раствора 20 микрограмм на миллилитр для создания покрытия из декстрина высокой плотности. Решение Alexa 6 47.

Разбавьте 20 микролитров из 20 микрограммов на миллилитр раствора в общей сложности 200 микролитров деионизированной воды. Для раствора средней плотности разведите два микролитра в 200 микролитрах деионизированной воды. Для раствора низкой плотности разводят 0,2 микролитра.

В 200 микролитров деионизированной воды добавьте в каждую лунку по 200 микролитров разбавленных растворов декстрина Alexis X 47 и выдержите 10 минут. Можно использовать более длительное время инкубации, что может привести к более плотному покрытию декстрином. Наконец, удалите растворы Dexter Xis X 47 и промойте водой три раза.

Чтобы приготовить флуоресцентные актиновые нити на стекле, сначала добавьте 200 микролитров 0,01%-ного раствора полилизина в каждую лунку восьмикамерной. Накройте стекло и выдерживайте 10 минут. Удалите с помощью пипетки, чтобы убедиться, что жидкости не осталось.

Добавьте в каждую камеру по 90 микролитров общего актинового буфера, предварительно восстановленного в соответствии с инструкциями производителя. Затем добавьте 10 микролитров 10 микромоляров предварительно сформированного раствора актинового филамента и один микролитр фоида и Alexa 6 47 и аккуратно пипетируйте вверх и вниз для перемешивания, инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы приготовить микросферные флуоресцентные шарики в качестве реперных маркеров, разбавьте один микролитр гранул тепека до 200 микролитров PBS и перемешайте. Добавьте разведенные шарики в камеру для визуализации и подождите 15 минут.

Через 15 минут удалите раствор и трижды промойте PBS перед визуализацией, в этом эксперименте используются клетки, культивируемые примерно до 80% CO. Удалите питательную среду и промойте PBS. Затем добавьте 500 микролитров 4%-ного раствора формальдегида на 10 минут.

Удалите формальдегид и трижды промойте PBS. Не позволяйте клеткам оставаться сухими и всегда используйте буферизованные растворы PBS. Чтобы избежать гипотонического стресса, добавьте два микролитра 50 микрограмм на миллилитр стокового раствора EGF Alexa, от 6 47 до 200 микролитров 0,1% раствора БСА, а затем добавьте этот раствор в клетки хела.

Выдерживать 30 минут при комнатной температуре. Удалите раствор и трижды промойте PBS. Добавьте блокирующий раствор 0,1% BSA и оставьте на 15 минут при комнатной температуре.

После этого удалите блокирующий раствор и промойте еще три раза PBS перед визуализацией. Непосредственно перед визуализацией приготовьте буфер для переключения, смешав исходные растворы фермента глюкозы и восстановителя В соотношении 50 микролитров, 400 микролитров и 100 микролитров добавьте PBS, чтобы составить окончательный объем до одного миллилитра. Извлеките PBS из камеры визуализации, а затем заполните его до верха переключающим буфером.

Аккуратно наденьте крышку на верхнюю часть камеры, следя за тем, чтобы на ней вообще не было пузырей и вся камера была закрыта. Если вы видите какие-либо пузыри, долейте дополнительный буфер или PBS. В противном случае производительность буфера может снизиться.

Сбор высококачественных разреженных данных о связях имеет важное значение для успеха этой процедуры, поэтому убедитесь, что микроскопы правильно сфокусированы и используются правильные настройки сбора. Найдите флуоресцентную структуру, представляющую интерес для изображения. Выберите нужный угол освещения.

В этом случае рекомендуется использовать дерн или сильно наклоненный угол, так как это улучшает соотношение сигнал/шум за счет минимизации расфокусированного света, что особенно полезно для образцов клеток. Возьмите ссылку на ограниченное по дробям изображение структуры перед получением изображения шторма. Увеличьте возбуждающий лазер до высокой мощности, соответствующей примерно двум киловаттам на квадратный сантиметр при съемке с настройками камеры на 10-миллисекундную экспозицию и время цикла примерно 50 герц или кадров в секунду.

После того, как флора превратится в редкий мигающий узор, соберите 10 000 кадров. Чтобы начать эту реконструкцию. Откройте файл RAINSTORM M в MATLAB и запустите его в окне rainstorm.

Выберите файл изображения для анализа с помощью кнопки обзора. Это должен быть файл TIF. Измените ширину пикселя в соответствии с исходными данными микроскопа, используемого для сбора данных.

Оставьте остальные значения по умолчанию. Нажмите кнопку обработки изображений и подождите, пока не появится предварительное изображение. Продолжительность обработки будет зависеть от размера файла, спецификации компьютера и количества потенциальных ссылок в исходных данных.

Чтобы сгенерировать обновленное изображение в суперразрешении, нажмите кнопку открыть рецензент и появится второе окно. Нажмите кнопку регулировки контрастности, чтобы изменить отображение изображения по своему усмотрению. В некоторых случаях, когда изображение очень темное, максимальное значение следует уменьшить.

Используйте окно рецензента для создания полезных метрик качества изображения и дальнейшей доработки изображения в сверхвысоком разрешении. Оставьте для первых трех параметров контроля качества значения по умолчанию 5, 000, 0,1 и 0,8–3,5 соответственно. Обновите количество на одно значение фотона.

Измените пороговое значение точности локализации, чтобы найти компромисс между оптимизацией среднего значения локализации, точностью и числом локализации. В конечном изображении рекомендуются значения от 30 до 50 нанометров в зависимости от качества данных и образца. Масштабный коэффициент реконструкции по умолчанию равен пяти, что позволит создать пиксели сверхвысокого разрешения 32 нанометра, предполагая, что пиксель в исходных изображениях составляет 160 нанометров.

Если необработанные изображения имеют размер пикселя 100 нанометров, это позволит получить изображения со сверхвысоким разрешением и пикселями 20 нанометров. Увеличьте коэффициент масштабирования, чтобы получить пиксели сверхвысокого разрешения меньшего размера. На окончательном изображении нажмите кнопку run reviewer, чтобы создать обновленное изображение в суперразрешении.

Нажмите кнопку просмотра гистограмм, чтобы отобразить метрики качества изображения. Наконец, нажмите кнопку «Сохранить изображение» в рецензенте, чтобы сохранить все эти данные. Начните эту процедуру с создания изображения таким же образом, как показано ранее.

Нажмите кнопку отслеживания коробки в рецензенте, а затем щелкните и перетащите рамку на реперный маркер на просматриваемом изображении. Подождите, пока не появится новое изображение, на котором будут отображаться положения в рамке. При желании сохраните это изображение, если интересующий объект является реперным маркером.

Как и в данном случае, выполните коррекцию дрейфа, нажав кнопку «Установить якорь», а затем кнопку «Вычесть дрейф». Наконец, нажмите кнопку «Запустить рецензент» еще раз, чтобы создать новое изображение шторма. Успешное покрытие декстрином должно производить флуоресцентный монослой, и типичные данные о декстрине показаны на этом рисунке.

Изображения с дифракционным ограничением показывают различные концентрации декстрина до получения изображений шторма. Реконструкции со сверхвысоким разрешением имеют размер пикселя 25 нанометров. Было собрано 10 000 изображений с размером кадра 1 28 на 1 28 пикселей, и отдельные кадры показаны из этой последовательности.

При высокой концентрации декстрина. Флуоресцентный монослой должен выглядеть относительно однородным, как показано на этих изображениях и в этом видеофрагменте. При более низких концентрациях мигания будут казаться более редкими и сфокусированными.

При отсутствии очевидного фона на этой фазе получения изображения при постоянном лазерном освещении, количество миганий со временем будет уменьшаться, как показано на примере сравнения кадров 2000 и 8000 в выборке с высокой плотностью. Основное различие между изображениями сверхвысокого разрешения с высокой, средней и низкой концентрацией декстрина заключается в уменьшении числа локализаций. На этом графике показано в среднем три последовательности кадров по 10 000 кадров для каждой концентрации декстрина, где полосы погрешности указывают на стандартное отклонение.

Однако эта пропорциональная зависимость между концентрацией флуоресцентных молекул, числом миганий в исходных данных и числом локализаций не является простой линейной, как показано на этом графике числа принятых локализаций на кадр. Используя скользящее 100-кадровое среднее при очень высокой плотности молекул, программное обеспечение не может успешно локализовать молекулы при визуализации любого образца. Распространенной проблемой может быть наличие яркой, но несфокусированной флуоресцентной дымки на изображении, вызванной диффузией силы флюороса через среду.

Эти отделенные флуоресцентные молекулы можно предотвратить или удалить, увеличив количество этапов промывки с помощью PBS перед добавлением буфера переключения или добавив свежий буфер переключения в камеру обработки и сравнивая данные из каждой последовательности изображений, что приводит к получению очень разных изображений со сверхвысоким разрешением. Панели C и D представляют собой конструкции изображений со сверхвысоким разрешением, соответствующие данным, собранным на панелях A и B соответственно. На этом графике показано количество принятых локализаций на кадр с использованием скользящего среднего значения 100 кадров.

Красная линия соответствует последовательности штормов A и C при высоком фоне, синяя линия соответствует B и D при низком фоне. Принятое число локализации для изображений, соответствующее высоким и низким фоновым данным, показано на втором графике. Эти три дифракционных ограниченных изображения показывают типичные данные предварительно сформированных актиновых филаментов, прилипших к поверхности стекла до добавления буфера переключения и визуализации грозы.

Можно увидеть переменную длину нитей. Очень яркие нити часто представляют собой несколько нитей, спутанных между собой. Выбор одиночных относительно ярких нитей, а не запутанных областей, приводит к более высокому качеству изображений на этапе съемки.

Яркие в фокусе мигания должны быть видны по всей длине нити накаливания. Редкое мигание должно быть видно на этапе сбора данных, а затем в технологических данных. Должна быть тонкая непрерывная нить в локализациях, каждый кадр должен показывать постепенное снижение.

Как правило, полное с половинным максимумом или FWHM нити задается в качестве эмпирической оценки разрешения путем проведения прямой линии через увеличенную область актинового волокна с использованием функции профиля графика на изображении J и последующей гауссовской аппроксимации. FWHM рассчитывается как 43,2 нанометра. Проблема неправильной локализации может возникнуть в тех случаях, когда ряд актиновых филаментов разветвляются и/или пересекаются друг с другом путем обработки подмножеств кадров и сравнения первого и последних 5000 кадров.

На изображении в сверхвысоком разрешении создается другое изображение с использованием первых 5 000 кадров. В середине изображения видно множество локализаций. Однако при использовании последних 5 000 кадров очень немногие из этих локализаций очевидны, и только нити остаются нетронутыми, хотя и в некоторой степени непрерывными, из-за небольшого количества локализаций на изображении.

Если есть подозрение на слишком высокую плотность мигания, сравнение изображений с данными локализации на кадр может убедительно свидетельствовать о том, что эта проблема возникает во время первого набора кадров. Среднее количество локализаций на кадр составляет более 10 по сравнению с последним набором кадров, где оно составляет примерно четыре. Еще одной потенциальной проблемой в штормовой микроскопии является дрейф, который происходит, когда образец движется относительно линзы объектива.

Первым признаком того, что мог произойти боковой дрейф, является то, что структура больше, чем ожидалось. Например, при относительно большом полном с половинным максимумом по сравнению с прецизионным пределом данных от ливня, в данном случае 90 нанометров по сравнению с 67 нанометрами. Лучший способ обнаружить дрейф — сравнить локализации в зависимости от времени IE, чтобы увидеть, смещаются ли локализации в более поздних кадрах по сравнению с ранними кадрами.

Это хорошо видно в случае с актиновыми нитями при отображении с помощью цветового кода. При использовании функции отслеживания коробки во время ливня, как показано на панелях, локализации B и c отображаются цветом, соответствующим номеру кадра на момент их получения. Например, локализации на ранних этапах последовательности сбора данных обозначены синим цветом, а локализации на поздних этапах — красным

Смещенные цвета указывают на то, что произошел дрейф для измерения и коррекции. Для дрейфа флуоресцентные бусины диаметром 100 нанометров могут быть использованы в качестве реперных маркеров: номера с первого по четвертый показывают обрезанные и увеличенные бусины по отдельности. В примере, где наблюдается относительно сильный дрейф примерно в 100 нанометров в течение трех минут 10 секунд во время фазы захвата, та же функция отслеживания коробки может быть использована для цветовой кодировки и подтверждения того, что дрейф произошел, поскольку все четыре бусины в этом примере показаны почти одинаковыми дрейфами, можно выбрать одну из них, в данном случае две бусины для использования в качестве эталона и вычесть дрейф из других бусин.

Сравнение с панелью Е показывает, что боковой дрейф был скорректирован. Наконец, эпидермальный фактор роста, окрашенные клетками пятки, могут быть использованы для получения реалистичного примера разрешения изображения. На панели ячеек А показано дифракционно ограниченное изображение части хела-клетки, сфокусированное на поверхности базальной клетки, где желтые прямоугольники указывают на увеличенные области интереса, показанные на панелях В и С, в отличие от нечетких увеличенных областей интереса на изображении, ограниченном дифракцией.

Изображения со сверхвысоким разрешением должны показывать смесь кластеров, иногда изолированных отдельных пикселей. Кластеры будут иметь диаметр около 100 нанометров и, вероятно, будут соответствовать образующимся ямкам и везикулам. Путь, по которому EGF преимущественно подавляется и эндоцитозируется по количеству локализаций на кадр с панели D, представлен на графике G. После просмотра этого видео вы должны хорошо понять, как сделать несколько простых тестовых образцов, получить данные и реконструировать шторм высокого качества, увидеть изображения с разрешением.

Эти методы помогут избежать некоторых распространенных ловушек посадки, таких как дрифт, и помогут оптимизировать шторм. Смотрите эксперименты с разрешением.