Одновременно Захват изображения в реальном времени в двух выбросов каналов Использование Разделение системы двойной камеры выбросов: Заявки на клеточной адгезии

Общая цель этой процедуры заключается в проведении анализа адгезии в камере параллельного проточного потока пластин с использованием системы разделения излучения с помощью двойной камеры для одновременной записи последовательностей изображений в режиме реального времени в двух цветах. Для этого сначала выравниваются две камеры на устройстве обработки изображений. Затем подготавливаются ячейки и реакционноспособный субстрат, а также настраивается проточная камера с параллельными пластинами.

Затем настройки камеры калибруются для получения двухцветного изображения, и все необходимые цифровые поправки вносятся в выравнивание камеры. Затем захватываются последовательности изображений, которые демонстрируют получение двойных цветных изображений с высоким временным разрешением. Преимущество систем разделения излучения с двумя камерами по сравнению с системами с одной камерой заключается в том, что каждой камере может быть назначено разное время экспозиции, при этом сохраняется полное поле зрения.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточной адгезии, например, как локализация молекул адгезии на поверхности клеток может повлиять на динамические биологические процессы, такие как миграция клеток, воспаление и метастазирование рака. Для следующей процедуры требуется инвертированный эпифлуоресцентный микроскоп. Он должен быть оснащен источником света высокой интенсивности, соединенным со световодом, комбинированным фильтрующим кубом и системой камер с разделением излучения с двумя камерами.

Микроскоп должен быть подключен к компьютеру с программным обеспечением для обработки изображений, способным собирать и объединять изображения, полученные монохромными ПЗС-камерами. Здесь используется многокамерное программное обеспечение stream picks five с модулем simul picks. Начните с открытия выбора пяти потоков на ленте задач, выберите рабочую область.

Затем в правой части экрана откройте Менеджер рабочих областей и выберите новое рабочее пространство. После присвоения имени камере следуйте подсказкам программного обеспечения, чтобы выбрать из предварительно заполненного списка, граббер, соответствующий модели камеры, в рабочем пространстве появится небольшой значок камеры, указывающий на то, что изображение с камеры получено. Объекты, полученные с помощью микроскопа, теперь можно рассматривать на экране.

Повторите этот процесс для второго рабочего пространства камеры, затем для объединенного рабочего пространства повторите этот шаг еще раз, и все камеры будут заняты. Появится сообщение об ошибке. Это сообщение обычно назначает камеры из рабочего пространства один и два в объединенное рабочее пространство на док-панели, расположенной в правой части экрана просмотра.

Изображения в первой и второй рабочих областях будут наложены в объединенной рабочей области как два псевдоцветных изображения. Самым сложным аспектом этой процедуры является юстировка камеры. Чтобы обеспечить успех, мы используем предметное стекло производителя, скрупулезно следуя инструкциям производителя.

Чтобы выровнять камеры в двухкамерной системе разделения излучения, подайте светлопольный или фазово-контрастный свет в окуляр микроскопа. Поместите калибровочную сетку с металлическим покрытием, предоставленную производителем, на предметный столик микроскопа и выровняйте сетку на предметном столике микроскопа. Отобразите сетку без биннинга и без автоматического масштабирования и сфокусируйте ее, затем переместите, но не снимайте дихроичный корпус, чтобы выровнять камеру один.

Затем с помощью диска регулировки фокусировки на первой подводной горе снова сфокусируйте изображение. Затем полностью вставьте корпус дихроичного устройства в двухканальное устройство сбора данных, чтобы изображение было разделено дихроичным устройством на обе камеры. Ослабьте установочные винты 3 5 60 четвертых дюймов и поверните вторую камеру на гнездовом порту крепления CM два до тех пор, пока ориентация сетки не станет идентичной на обоих изображениях, используя диск регулировки фокусировки на втором порту крепления C, сфокусируйтесь на изображении со второй камеры.

Чтобы завершить выравнивание, используйте ручку RL на правой стороне DC 2, чтобы отрегулировать объединенные положения изображения до нужного подъема. Вертикальная граница изображений точно выровнена в объединенном рабочем пространстве. Затем с помощью ручки UD отрегулируйте выравнивание второго изображения вверх вниз до тех пор, пока горизонтальные полосы сетки не будут правильно выровнены.

Если во время выравнивания вверх вниз происходит небольшое вращение камеры, устраните эту проблему, ослабив 3 5 60 четвертых дюймовых винтов для второй камеры и вращая до тех пор, пока отображаемое изображение не будет правильно выровнено. Подготовьте клетки рака молочной железы BET 20 для анализа адгезии в проточной камере с параллельными планшетами, окрашивая их анти-CD 24 и TECA 4-5-2 с использованием вторичных препаратов LOR 5, 68 и 4, 88, как описано в сопроводительном документе, обязательно подготовьте соответствующие одноцветные контрольные элементы после окрашивания, диспенсируйте клетки в резервуар проточной камеры параллельной пластины. Подсоедините две отдельные длины трубки к впускному и выходному отверстиям проточной камеры.

Одна трубка будет подключена к резервуару, содержащему меченые клетки, взвешенные в DPBS плюс содержащие 0,1% PSA. Подсоедините другую трубку к шприцевому насосу, который будет откачивать жидкость с заданной скоростью потока. Подключите вакуумную линию к проточной камере и расположите проточную камеру над 35-миллиметровой чашкой для культуры тканей, содержащей монослой клеток яичников китайского хомяка, экспрессирующих лектин или клетки choe.

Отрегулируйте проточную камеру и прокладку проточной камеры, чтобы обеспечить надлежащее вакуумное уплотнение. Откачайте жидкость из резервуара, контролируя узел проточной камеры на предмет надлежащего уплотнения. Наконец, поместите узел проточной камеры на микроскоп, включите источник света и установите микроскоп путем ручного осмотра.

Убедитесь, что дихроичный корпус находится в правильном нажатом рабочем положении и не находится в режиме байпаса. Вручную переключитесь в режим флуоресценции и выберите зеленый, красный куб флуоресцентного фильтра, чтобы определить время экспозиции и усиление отдельно. Визуализируйте клетки с помощью красной флуоресценции в первой камере и зеленой флуоресценции во второй камере.

Вручную нажимаем на дихроич по мере необходимости для получения изображений. Далее вносят суспензию из БТ 20 клеток, окрашенных только красной флорой. Четыре сопряженных антитела в резервуаре соединены с входным отверстием проточной камеры параллельной пластины.

С помощью шприцевого насоса перфузируйте ячейки BT 20 над монослоем чой в проточной камере с параллельной пластиной. В настройках программного обеспечения для обработки изображений в реальном времени отрегулируйте время экспозиции камеры номер один, чтобы получить изображение в красном канале. Сопоставьте время экспозиции второй камеры со временем экспозиции первой камеры.

Если изображение наблюдается в зеленом канале, то присутствуют артефакты утечки. В этом случае сохраняйте эквивалент времени экспозиции в первой и второй камерах и уменьшайте время экспозиции до тех пор, пока артефакт утечки не перестанет быть виден в зеленом канале. При необходимости отрегулируйте усиление камеры номер один, чтобы улучшить видимость изображения в красном канале.

Затем удалите из резервуара оставшуюся суспензию элементов BT 20 и замените суспензию на DPBS. С помощью шприцевого насоса перфузируйте раствор над монослоем чой до тех пор, пока ячейки BT 20 не перестанут быть заметными на монослое. Наполните резервуар суспензией клеток BT 20, окрашенных только зеленым фторуглеродным конъюгированным антителом.

Повторите процесс калибровки камеры с помощью зеленых одноцветных элементов управления. На этот раз определите время экспозиции с помощью второй камеры для изображения ячеек в зеленом канале без просвечивания артефактов в красном канале, собранных первой камерой. Используйте программное обеспечение для обработки изображений для одновременного просмотра изображений, полученных с двух монохромных ПЗС-камер в проточной камере. Эксперимент.

Объедините изображения, собранные с обеих камер, с помощью модуля simul pics выбора потока. Используйте корректировки цифровой коррекции в одновременном изображении или альтернативном программном обеспечении для пространственного выравнивания объединенных изображений. При необходимости изображения могут быть скорректированы с помощью модуля simul PIC для горизонтальной, вертикальной и вращательной корректировки.

Теперь система готова к использованию для одновременной съемки двух цветных изображений. Для демонстрации системы разделения излучения с помощью двойной камеры, описанной в этом видео, был использован анализ адгезии в проточной камере. Как показано на рисунке, система обнаружила клетки BT 20, которые были флуоресцентно помечены античеловеческим CD 24, показанным красным цветом, и HECA 4 52, который связывается с молекулами, связанными с SCO, показанными зеленым цветом.

Некоторые подвижные ячейки отображали красные, но не зеленые сигналы. Другие отображали зеленые сигналы, но не красные, а третьи ячейки отображали как красные, так и зеленые сигналы. Здесь. Камеры сохраняли оптическое и временное разрешение для отслеживания особенностей клеток на клетке, кувыркаясь и переворачиваясь по мере того, как она катилась по реакционноспособной подложке в направлении потока, объединенных каналов излучения, выявляли распределение и колокализацию CD 24 и насыщенных молекул на поверхности клеток BT 20, скатываясь и прилипая к монослоям CHO e.

На этих изображениях показано изображение одной ячейки BT 20, в которой CD 24 и насыщенные молекулы локализованы и выглядят как желтые или оранжевые пятна при слиянии красных и зеленых псевдоцветных эмиссионных каналов. Взятые вместе. Эта информация демонстрирует, что система разделения излучения с двумя камерами имеет пространственное, временное и оптическое разрешение, необходимое для выявления клеточных и молекулярных особенностей в таких приложениях, как анализ адгезии в проточной камере, при котором клетки быстро перемещаются по полю зрения.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как настроить и откалибровать систему разделения излучения с двумя камерами или визуализировать адгезионный анализ камеры параллельного проточного потока пластины в режиме реального времени в двух цветах. Этот метод может быть применен к другим анализам in vitro, которые используют флуоресценцию для изучения поведения клеток.