Химически заблокирован антител Microarray для мультиплексный высокой пропускной профилирования конкретных гликозилирования белков в сложных образцов

В этой видеостатье описана процедура получения профилей гликозилирования 20 различных гликопротеинов в образце сыворотки крови пациента с гепатоцеллюлярной карциномой с использованием химически заблокированного микрочипа первого гликопротеина Специфические антитела печатаются непосредственно на предметных стеклах микрочипов, а гликаны антител блокируются для предотвращения связывания лектинов. Когда применяются образцы сыворотки крови пациента, гликопротеины из образца захватываются антителами. Затем добавляют биотинилированные гликан-связывающие белки для обнаружения гликанов и диконъюгированный neu travain для маркировки биотинилированных лектинов.

Затем предметное стекло микрочипа сканируется для обнаружения флуоресценции, анализ полученных данных позволяет выявить профили гликозилирования белков образца. Этот метод имеет ряд преимуществ по сравнению с существующим методом, таким как ВЭЖХ. Этот метод позволяет выявить отдельные гликопротеины в их нативном статусе.

Быстрее и проще проводить скрининг изменения гликозилирования для нескольких белков одновременно. Итак, мы обнаружили, что биомаркеры заболеваний, особенно рака и рака печени, которые мы рассмотрели наиболее тщательно, часто являются гликозилированными. А способность обнаруживать специфические формы глико, которую мы обнаружили, значительно повышает эффективность биомаркеров в их чувствительности и специфичности.

Таким образом, эта мера может дать представление об изменениях гликозилирования на нескольких сывороточных белках при ГЦК. Он также может быть применен для изучения патологии и открытия биомаркеров при других видах рака и заболеваниях, таких как рак поджелудочной железы, диабет и болезнь Альцгеймера. Демонстрировать процедуру будет Чэнь Лу, техник из моей лаборатории.

Начните этот протокол с подготовки микрочипа антител сначала в микроцентрифужных пробирках объемом 0,8 миллилитров на льду разведите все антитела, которые будут использоваться для печати микрочипов до концентрации 0,5 миллиграмма на миллилитр минимум в 40 миллилитров PBS здесь, 26 различных антител будут использоваться в качестве положительного контроля. Также приготовьте такое же количество 0,5 мг на миллилитр биотинилированного БСА в PBS. С помощью пипетки введите 40 миллилитров каждого антитела в 384-луночную исходную пластину на льду.

Затем в программном обеспечении для управления микрочипом обозначьте местоположение каждого антитела. Затем загрузите пластину на микрочип в качестве источника. Затем загрузите 20-траекторные микрочипы на микрочип в качестве мишени.

Настройте микрочип на печать 48 идентичных субарных матриц, в которых 27 антител и контрольных белков расположены в трех экземплярах по схеме девять на девять. Запустите микрочип, чтобы распечатать слайды микрочипа антител. Соберите предметные стекла микрочипов антител и сохраните их в кассете с адсорбентом.

Запечатайте кассету в полиэтиленовый пакет, чтобы предотвратить денатурацию белка и попадание влаги на предметные стекла во время хранения. Храните запечатанные предметные стекла микрочипа при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока они не будут использованы. Самым сложным и важным аспектом этой процедуры является этап химического блокирования.

Для обеспечения успеха крайне важно, чтобы на микроматрице было напечатано достаточное количество антител. Всегда готовьте свежий ИД натрия и гидроцит агрокислоты непосредственно перед экспериментом. И обязательно проводите процедуру окисления при четырех градусах, избегая попадания света.

Достаньте предметные стекла микрочипа из холодильника и уравновесьте их до комнатной температуры в течение 30 минут. Извлеките предметное стекло из ящика для хранения. Ненадолго погрузите предметное стекло в умывальник с PBS с 0,1% до 20%.

Затем погрузите предметное стекло в 15 миллимолярный буфер ацетата натрия с 0,1% твином на 10 минут. Затем приготовьте свежий 150 миллимолярный натрий на йодат в 15 миллимолярном буфере ацетата натрия и переложите его в скользящую умывальник. Храните в холодильнике, избегая света до использования. Снимите предметное стекло с буфера ацетата натрия и поместите его в таз со свежим пуриатом натрия стороной антител вверх.

Накройте таз алюминиевой фольгой, чтобы избежать попадания света. Затем поставьте горку на четыре градуса Цельсия с легким встряхиванием на два часа. Выньте предметное стекло из тазика и кратковременно промойте его в буфере ацетата натрия три раза в течение пяти минут.

Инкубировать предметное стекло в 300 миллилитрах свежеприготовленного 10 миллимолярного раствора блокировки гидроглутаминовой кислоты в инкубационной камере в течение двух часов при комнатной температуре с легким встряхиванием. Выньте предметные стекла из камеры и промойте их PBS с 0,1%-ным двигателем в течение трех минут. Затем в бассейне для мытья предметных стекол инкубируйте предметное стекло микрочипа в 300 мл 1% BSA в PBS с 0,5% в течение одного часа при комнатной температуре с легким встряхиванием.

Промойте предметные стекла в PBS с 0,1%-ной матрицей три раза в течение трех минут. Поместите предметное стекло на решетку для слайдов и вращайте со скоростью 1,200 G в течение двух минут, чтобы высушить предметное стекло микрочипа. Чтобы отделить каждый субарный массив, на предметном стекле отпечатывается восковая сетка.

После предварительного нагрева воскового импринтера до 70 градусов Цельсия в течение пяти минут загрузите заблокированное предметное стекло микрочипа в восковой импринтер стороной антитела к воску. Аккуратно потяните за ручку, чтобы равномерно нанести воск на предметное стекло. Этот метод может быть использован для выполнения анализов гликопрофилирования для одного образца или для измерения одного гликоэпитопа в нескольких образцах.

Здесь мы продемонстрируем анализы гликопрофилирования. Начните с разбавления 40 микролитров сыворотки в 360 микролитрах PBS, содержащих 0,1% 0,1% и 100 микрограммов на миллилитр, каждый из которых содержит IgG мышей, крыс, кроликов, коз и ослов. Этого объема достаточно для нанесения шести микролитров разбавленного сывороточного раствора на каждую подматрицу.

Осторожно нанесите шесть микролитров разведенного образца или контрольной группы на каждый подмассив предметного стекла. Выдержите предметное стекло во влажной кассете с влажными бумажными полотенцами при комнатной температуре в течение одного часа. Промойте предметное стекло PBS с 0,1%tween три раза в течение трех минут.

Затем высушите предметное стекло, вращая его при температуре 1200 G в течение двух минут. Приготовьте 20 микролитров биотинилированных гликан-связывающих белков в концентрации 10 мг на миллилитр в подростке PBS в микропробирке объемом 0,8 мл на льду. Нанесите шесть микролитров разведенных биотинилированных лектинов на каждый подмассив предметного стекла и инкубируйте во влажной коробке для предметного стекла с влажными бумажными полотенцами при комнатной температуре в течение одного часа.

После промывки предметных стекол PBS с 0,1% подростковой массой три раза, как и раньше, высушите предметное стекло, вращая его при температуре 1200 раз G в центрифуге в течение двух минут. Приготовьте 400 микролитров по 10 мг на миллилитр DITE 5 49 меченый neut travain в PBS 0,1% твин в 0,8 миллилитровой микропробирке со льдом. С помощью повторяющегося пипеттера нанесите шесть микролитров DITE 5 49 меченого нейта на каждую подматрицу и инкубируйте предметное стекло в увлажненной кассете с предметным стеклом при комнатной температуре в течение одного часа после инкубации.

Промойте предметное стекло PBS 0,1%tween три раза в течение трех минут. Высушите предметное стекло, вращая его при температуре 1200 G в центрифуге в течение двух минут. Отсканируйте предметное стекло с помощью флуоресцентного микрочипового сканера с разрешением 10 миллиметров.

Настройки лазера и ФЭУ должны быть как можно более строгими, при этом не наблюдаться насыщения. Откройте изображение в массиве Pro 3.2. Настройте шаблон массива в соответствии с картой массива, на которой указаны места пятен антител.

Тщательно выровняйте каждый шаблонный круг по соответствующему пятну на изображении, извлеките интенсивность каждого пятна в файл Excel для дальнейшего анализа. Микрочип антител, содержащий 48 идентичных субарных матриц с 26 антителами против 20 сывороточных гликопротеинов и биотина. BSA была разработана и изготовлена, как описано в этом видео, чтобы изучить важность процедуры блокировки.

При анализе профилирования гликопротеинов были получены два идентичных предметных стекла микрочипов. Один из них не был химически заблокирован, в то время как другой контрольный образец был нанесен на субарные матрицы в первой и третьей колонках, а объединенный образец сыворотки ГЦК был нанесен на субарные матрицы. В столбцах второй и 4 22.

Затем биотинилированные лектины, специфичные для различных гликанов, были нанесены на каждую субматрицу, как показано на этих изображениях субарных матриц. Лектины, связанные с захватом антител в контрольных колонках, дают высокий фон, который был неотличим от загруженных сывороткой колонок в незаблокированных микрочипах. Однако, когда тот же эксперимент проводили на химически заблокированном предметном стекле микрочипа антител, не наблюдалось или наблюдалось очень низкое связывание для захвата антител в контрольных колонках и высокое связывание антигена в колонках, загруженных сывороткой.

Эти результаты демонстрируют, что процедура химического блокирования является критическим этапом для измерения гликанов на захваченных антителами гликопротеинах. Эту методику можно сделать за восемь часов, если она выполнена правильно. Антитела при модификации могут терять сродство к своим антигенам и другим свойствам.

Поэтому важно помнить об этом и использовать несколько разных антител в разных источниках антител после этой процедуры. Другие измерения, такие как определение концентрации каждого белка с помощью того же микрогеометрического стекла, могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, связано ли изменение гликозилирования с изменением уровней экспрессии белка или исключительно из-за изменения гликозилирования на каждом отдельном белке. Не забывайте, что работа с образцами сыворотки, содержащими патогены, может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как защитные перчатки.