ДНК-микрочипов: Контроль качества образцов, Array Гибридизация и сканирования

Общая цель этой процедуры заключается в проведении эксперимента с микрочипами с использованием автоматизированного смесителя. Это достигается путем предварительного анализа качества образцов РНК с помощью биоанализатора, а затем амплификации и мечения РНК. Образцы РНК гибридизуются с микрочипами.

Наконец, гибридизованные микрочипы промывают и сканируют. В конечном итоге получены результаты, которые показывают дифференциальную экспрессию РНК-транскриптов посредством анализа двухцветных флуоресцентных изображений микрочипов. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы гибридизации микрочипов трудно изучить из-за специализированного оборудования.

Анализ контроля качества начинается с подготовки биоанализатора 2, 100 и станции прайминга чипов в соответствии с указаниями в описанной методике. Затем гелевую матрицу фильтруют путем пипетирования 550 микролитров в спиновой фильтр, снабженный центрифугой на основе РНК 6000 нанокомплекта. Фильтр при 1, 500 RCF в течение 10 минут при комнатной температуре.

Затем аликвотируйте отфильтрованный гель в 65 микролитров аликвот, которые можно хранить при температуре четыре градуса Цельсия до одного месяца. Перемешайте концентрат красителя в течение 10 секунд и добавьте один микролитр к 65 микролитру аликвоты. Отфильтрованный гель после вортексирования смеси центрифугируют при 13 000 RCF в течение 10 минут при комнатной температуре для прогона образцов.

Сначала установите стружку на станцию грунтовки. В этой демонстрации используется РНК 6000 наночипов. Загрузите девять микролитров смеси гелевых красителей в лунку, отмеченную белой буквой G на черном фоне.

С наконечником пипетки, расположенным на самом дне лунки. Установите поршень шприца на один миллилитр и закройте станцию заправки. Медленно, но неуклонно нажимайте на поршень, пока он не будет удерживаться зажимом.

Через 30 секунд отпустите зажим и дайте поршню подняться на несколько секунд. После того как поршень остановится, потяните поршень обратно в положение в один миллилитр и откройте станцию заливки. Загрузите девять микролитров гелевой матрицы.

Перемешайте в каждой из двух лунок. Марк Г. Затем нанесите по пять микролитров маркера в лунку лестницы и в каждую из 12 лунок для образцов. Следующая загрузка одного микролитра денатурированного трапа в лунку для проб и по одному микролитру каждого денатурированного образца в лунки для проб.

Наконец, добавьте по одному микролитру маркера в каждый неиспользованный образец. После загрузки закрутите чип на одну минуту со скоростью 2 400 оборотов в минуту. После запуска экспертного программного обеспечения 2, 100 установите чип и закройте крышку.

Убедитесь, что выбран правильный порт, и запустите анализ в течение пяти минут после загрузки образцов, чтобы предотвратить испарение. С методами выполнения амплификации и мечения РНК можно ознакомиться в письменном протоколе. После мечения очистите CRNA, чтобы удалить все неинкорпорированные нуклеотиды Используя когены и простые мини-колонки, меченые CRNA затем можно количественно определить с помощью спектрального фотометра NanoDrop 2000.

В режиме измерения микрочипа записывайте концентрацию образца, выход и удельную активность. Для гибридизации микрочипов необходимо достичь выхода не менее 825 нанограмм и удельной активности не менее восьми пикомолев на микрограмм не менее чем за два часа до гибридизации микрочипов. Включите станцию гибридизации и установите на 65 градусов Цельсия.

Данный протокол описывает использование 4K матриц Agilent четыре на 40 с системой гибридизации Roche nimble gen и четырьмя камерами смесителя, после фрагментации CRNA, выполненной в соответствии с письменным протоколом, для подготовки камеры гибридизации. Поместите предметное стекло микрочипа в сторону инструмента для разборки сборки. Сначала откройте миксер A four и обнажите клей, удерживающий массив и инструмент для разборки сборки, чтобы предотвратить любое движение.

Поместите миксер A four на предметное стекло, начиная с дальнего конца. Убедитесь, что он правильно выровнен по инструменту и приклейте миксер вдоль массива. Потяните ползунок с конца миксера, чтобы снять узел слайд-миксера.

С помощью инструмента для обшивки надавите на клеевую прокладку по всей длине, чтобы убедиться, что она плотно приклеена к предметному стеклу. На темном фоне видны мелкие пузырьки воздуха, застрявшие между клеем и предметным стеклом. Уделите дополнительное время, чтобы удалить эти пузырьки с помощью инструмента для обшивки.

Теперь массив готов к загрузке. Используйте перпет положительного вытеснения для загрузки 100 микролитров образца для гибридизации. Плотно вставьте наконечник внутрь иллюминатора и медленно и плавно выдавливайте, чтобы воздух не задерживался в зоне массива.

Когда проба покроет весь массив и жидкость начнет выходить, вентиляционное отверстие быстро извлеките пипетку, отпустите только поршень. Как только наконечник окажется в стороне от предметного стекла, аккуратно промокните лишнюю жидкость в обоих портах, стараясь не вытащить образец из самой камеры. Затем закройте иллюминаторы наклейками с помощью пинцета.

Наденьте предметное стекло на станцию гибридизации и убедитесь, что отверстия для мочевого пузыря правильно расположены над уплотнительными кольцами. Это обеспечит правильное перемешивание при гибридизации. Закройте задвижную крышку и крышку станции.

Установите станцию в режим микширования B и гибридизируйте массив при температуре 65 градусов Цельсия в течение 17 часов. После того, как заполнение стеклянной тарелки с маркировкой А с буфером мойки единица, должно быть достаточно большим, чтобы вместить инструмент для разборки сборки, а также обеспечить некоторое маневрирование. Все промывки следует проводить в стеклянной посуде, так как пластик имеет тенденцию к выщелачиванию соединений, что приводит к высокому фону в массиве.

Положите решетку для горок и перемешивание в форму для окрашивания. С маркировкой В, наполните форму буфером для мытья, одним из которых накрываем решетку, и поставьте блюдо на тарелку для перемешивания при комнатной температуре. Кроме того, добавьте полоску для перемешивания в пустую форму для окрашивания с надписью C и выложите на тарелку для перемешивания.

Снимите массив со станции гибридизации и поместите его в инструмент для разборки сборки. Погрузите всю сборку в чашку, держа одной рукой инструмент для разборки сборки и слайд с противоположных сторон. Осторожно снимите миксер A four, стараясь не поцарапать область массива.

Быстро поставьте предметное стекло на решетку и посуду для окрашивания В. Воздействие воздуха должно быть сведено к минимуму, так как пять красителей SCI чувствительны к озону. Промойте стирание в течение одной минуты, помешивая на средней скорости. Заполните форму для окрашивания C с предварительно подогретым буфером для стирки два.

Переложите горки и постирайте в течение одной минуты. После мытья очень медленно снимите решетку для слайдов с окрашивания посуды C, чтобы свести к минимуму капли, оставшиеся на предметном стекле. Высушите предметное стекло путем вращения в течение двух минут.

Затем поместите предметное стекло в коническую трубку объемом 50 миллилитров и немедленно заполните его сканированием газа аргона, используя сканер Gene Picks 4000 B от молекулярных устройств, чтобы избежать показанной потери сигнала. Вот примеры четырех образцов РНК, выделенных из человеческого мозга. Качество образца опухолевой ткани оценивали с помощью биоанализатора 2,100 на чипе РНК 6,000.

Сплошные и открытые стрелки указывают положение 18 s и 28 видов S-R-R-N-A соответственно. Число целостности РНК или RIN является количественным измерением качества РНК good quality Total. Образцы РНК должны давать только два основных пика при прохождении в биоанализаторе для контроля качества, соответствующих двум основным видам рибосомных РНК.

Некоторая деградация РНК проявляется в виде мазка перед первым пиком рибосомной РНК и значительно более низкого пика для 28 S-R-R-N-A при сильной деградации. РНК низкого качества будет демонстрировать широкий пик или серию пиков при низком времени удержания. В то время как два пика рибосомной РНК будут иметь очень низкую интенсивность или вообще не будут идентифицированы.

Матрицы хорошего качества должны выдавать высокий сигнал при относительно низких значениях ФЭУ. Ожидается, что большинство транскриптов будут присутствовать на одинаковых уровнях в экспериментальной и референтной выборке. Массивные широко распространенные изменения в экспрессии генов, вероятно, не будут иметь никакого биологического значения.

Поэтому большая часть массива должна выглядеть желтой, а не зеленой или красной. Сигналы хорошего качества также должны находиться в динамическом диапазоне, таком, чтобы гистограммы сигнала полностью перекрывались, как видно на диаграмме рассеяния изображения массива. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить эксперимент с микрочипом с использованием автоматизированного гибридизационного аппарата.