Высокопроизводительная совместимая платформа на основе FRET для идентификации и характеризации модуляторов легкой цепи ботулинического нейротоксина

Общая цель этой процедуры заключается в скрининге малых молекул на ботулинический нейротоксин, ингибирующий легкую цепь. Это достигается путем предварительного приготовления серии разбавления компаунда с высокой точностью и прецизионностью. Второй шаг заключается в переносе составных разведений в черную 96-луночную пластину.

Далее в пластину добавляют разведенный фермент легкой цепи и фермент инкубируют с соединением в течение пяти минут при комнатной температуре. Заключительным этапом является добавление подложки для ладов легкой цепи для инициирования реакции, которая контролируется с помощью считывателя флуоресцентных пластин. В конечном счете, вторичные скрининги, в которых используется нефлуоресцентный пептидный субстрат, должны быть использованы для подтверждения активности соединения и определения более строгих кинетических констант, таких как константа диссоциации ингибитора или ki.

Основное преимущество этого анализа по сравнению с существующими методами, такими как методы на основе ВЭЖХ или клеточные методы, заключается в том, что он прост в выполнении, легко автоматизирован и может быть использован для сравнения относительной активности ряда соединений. У людей могут возникнуть трудности при использовании этого метода при приготовлении серии разведения и правильном смешивании пластины после добавления всех компонентов. Начните эту процедуру с подготовки буферов и реагентов, как описано в текстовом протоколе.

Настройте считыватель пластин так, чтобы он встряхивал пластину со средней скоростью в течение 10 секунд, а затем контролировал флуоресценцию на длине волны возбуждения 490 нанометров и длине волны излучения 523 нанометра каждые пять минут в кинетическом режиме в течение одного часа 30 минут при комнатной температуре. После определения диапазона концентраций соединения пробирки наносят этикетки с соответствующим названием соединения и концентрацией, Eloqua, 100% диметилсульфа оксида или ДМСО на все пробирки для подготовки их к составному разведению злаков. Далее приготовьте серийное разведение соединений для стандартной серии от одного до трех разбавлений.

Добавьте два микролитра неразбавленного соединения к четырем микролитрам ДМСО в первой пробирке серии разбавления и хорошо перемешайте с помощью нового наконечника для дозатора. Удалите два микролитра первого разбавления и добавьте до четырех микролитров ДМСО во вторую пробирку смеси. Хорошо повторите для оставшихся разведений.

Обязательно хорошо перемешайте составные разведения, чтобы убедиться в точности концентрации соединения. Накройте составные трубки и отложите их в сторону При комнатной температуре получите плоское дно, непрозрачное черное 96-луночное пластину. С помощью рекомендуемой настройки пластины, которую можно найти в текстовом протоколе.

Вручную дозируйте один микролитр соответствующего растворенного раствора непосредственно на дно каждой соответствующей лунки для лунок с первой по девятую, выдайте один микролитр самой высокой концентрации испытуемого соединения.11. В качестве соединения используется средство контроля собственной флуоресценции. Этот контроль предназначен для определения того, являются ли сами соединения флуоресцентными и/или влияют ли они на гидролиз субстрата.

Вручную дозируйте один микролитр известного мощного ингибитора в лунку, 12 в качестве положительного контроля и один микролитр 100% ДМСО в лунку. 10 в качестве отрицательного контроля с помощью автоматического дозатора дозируете. 79 микролитров буфера для анализа в сторону лунок, один через 10 и 12 и 89 микролитров в сторону лунки, 11.

Убедитесь, что наконечник не прикасается к дну колодца, где присутствует соединение, чтобы избежать перекрестного загрязнения колодцев. Vortex, разбавленный фермент легкой цепи, и с помощью автоматического дозатора добавьте 10 микролитров фермента в боковую часть каждой лунки, за исключением лунки 11. Аккуратно постукивайте по пластине, чтобы убедиться, что весь объем добавленного фермента уходит на дно лунки, аккуратно перемешайте, накройте крышкой и выдержите пластину в течение пяти минут при комнатной температуре.

Эта инкубация обеспечивает стадию предварительного равновесия для связывания соединений с легкой цепью. Перед добавлением субстрата осторожно нагнетайте ботулинический нейротоксин в субстрат легкой цепи. Затем с помощью автоматизированной пипетки добавьте по 10 микролитров субстрата сбоку от каждого.

Ну и обязательно добавьте субстрат на ту сторону лунки, которая противоположна той, куда фермент был добавлен ранее. Осторожно постучите по пластине, чтобы немедленно перемешать реагенты. Поместите планшет в считыватель флуоресцентных микротитровальных планшетов и начните ранее настроенную программу.

После завершения программы рассчитайте скорости ферментов, построив график зависимости единицы относительной флуоресценции от времени и вычислив наклон линии в течение линейного периода реакции. Подготовьтесь к автоматизированной операции для высокопроизводительного скрининга, как описано в текстовом протоколе, Демонстрация части протокола высокопроизводительного скрининга будет de young постдоком в моей лаборатории. Он покажет, как соединения переносятся в планшеты для высокопроизводительного скрининга с помощью оборудования для автоматизации лаборатории.

Назначьте участки на платформе для обработки жидкостей для составных планшетов, пробирных пластин и контейнеров с моющими растворами. Запрограммируйте манипулятор на размещение составных пластин и пробирных пластин в обозначенных местах и снятие крышек пластин перед штамповкой. Откалибруйте программное обеспечение программы штамповки и убедитесь, что штамповочные штифты погружены в воду, но не царапают дно пробной пластины.

Внесите 50 нанолитров соединения непосредственно в пробирную пластину, содержащую восемь микролитров ботулинического нейротоксина. Световая цепь. Очистите булавки после каждой пластины, окунув их в ДМСО, а затем высушив на промокательной бумаге и повторив этот процесс с изопропанолом и метанолом.

Наконец, высушите штифты над вентилятором после того, как соединения будут вбиты в пробирные пластины с ферментом. Отдельно сложите стандартные составные планшеты, и пробирные пластины накроют верхнюю пробирную пластину в стопке, чтобы предотвратить испарение, и отложите в сторону. Обязательно инкубируйте световую цепь с составами не менее пяти минут при комнатной температуре.

Более длительное время инкубации может быть использовано при штамповке большого количества пластин. Наконец, распределите субстрат по пробирным пластинам и измерьте флуоресценцию, как описано в текстовом протоколе. Независимо от того, проводите ли анализ ботулинического нейротоксина на основе ладов в виде легкой цепи с низкой или высокой пропускной способностью, увеличение флуоресценции должно наблюдаться с течением времени, когда ботулинический нейротоксин, легкая цепь, инкубируется с субстратом.

Если испытывать серийные разведения соединения, то часто получается ряд линий с различным наклоном. Здесь. Конечная концентрация соединения на основе гидрокси указана в микромолярных единицах. Ну, 10 в описанной здесь схеме номерного знака служит отрицательным контролем, где добавляется только транспортное средство.

Скорость этой реакции определяется как 100% активность фермента, и скорости в присутствии соединения могут быть нормализованы до этой скорости для получения относительной скорости или процентного ингибирования. Когда анализ проводится с последовательными разведениями соединения, график скорости реакции в зависимости от концентрации ингибитора может быть использован для определения половины максимальной концентрации ингибитора или IC 50. Диапазон разведения следует выбирать таким образом, чтобы график выглядел сигмовидной формой для оптимального подгонки кривой.

Значение IC 50 является относительным показателем активности, которое лучше всего описывается как кажущееся значение KI, поскольку оно зависит от концентрации фермента, присутствующего в анализе. Это значение затем может быть использовано для сравнения и ранжирования эффективности нескольких соединений в случае тестирования. В то же время, правильное перемешивание пластины после добавления каждого компонента имеет решающее значение для получения плавного линейного увеличения флуоресценции с течением времени, что необходимо для точного определения начальных скоростей.

На этом графике показан репрезентативный эксперимент, в котором не было достаточного смешивания, а скорость формирования продукта не является линейной во времени. После освоения этого метода анализ запутанных данных может быть выполнен менее чем за два часа для восьми соединений. После этого эксперимента можно провести другие анализы с нефлуоресцентными пептидными субстратами, чтобы подтвердить, что соединения ингибируют ботулинический нейротоксин, легкую цепь и соматическую активность.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как определить относительную активность ингибиторов легкой цепи ботулинического нейротоксина. Протокол был выполнен в три этапа. Во-первых, приготовление серии составных разбавлений.

Во-вторых, добавление рекомбинантного фермента легкой цепи, и, в-третьих, добавление флуоресцентной подложки и последующее измерение на считывателе флуоресцентных пластин