Выделение и количественная оценка ботулинического нейротоксина Из комплексных матриц с использованием BoTest Matrix Анализы

Общая цель этой процедуры заключается в количественной оценке протеолитической активности ботулинического нейротоксина в сложных матрицах, таких как фармацевтические, экологические и пищевые образцы. Это достигается путем предварительного испытания обработки и стандартных кривых образцов, если это необходимо, для установления подходящих условий pH и вязкости. Затем ботулинический нейротоксин иммуноципитируется из образцов с помощью магнитных шариков, покрытых антителами.

Затем магнитные шарики тщательно промываются для удаления любых мешающих соединений и ресуспендируются в оптимизированном реакционном буфере. Наконец, промытые шарики инкубируют с белковым репортером и спектроскопически измеряют расщепление репортера с течением времени. В конечном счете, сравнение расщепления репортера в тестовых образцах со стандартными образцами кривой используется для количественной оценки активности ботулотоксина в тестовых образцах с чувствительностью биопроб от мыши до ближней.

Основные преимущества этого метода по сравнению с другими методами, такими как мышиный, биопробный, иммунологический и другие флуоресцентные методы, заключаются в том, что этот анализ не требует использования на животных и был продемонстрирован для использования в очень сложных матрицах, обнаруженных в пищевых, экологических и фармацевтических образцах. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, могут испытывать трудности, потому что требуется тщательная обработка и разбавление образцов. Демонстрировать эту процедуру будет доктор Марк Даннинг, ученый из Bio Sentinel.

Подготовьте буферы в соответствии с текстовым протоколом для построения стандартной кривой для количественного определения тестовых образцов, отвесьте 10 плюс-минус 0,01 грамма образца твердого пищевого продукта в коническую пробирку объемом 50 миллилитров и отложите этот образец, который будет использоваться в качестве разбавителя во второй пробирке, отвесите два плюс-минус 0,01 грамма образца твердого пищевого продукта. Добавьте ботулинический нейротоксин или купленный на поверхность двухграммового образца пищи до конечной концентрации 30 000 MLD 50 на грамм пищи. Инкубируйте разбавитель и образцы с шипами при комнатной температуре или четырех градусах Цельсия в течение двух часов, чтобы дать боту время для взаимодействия с пищевой матрицей.

Имитируя естественное загрязнение, обратитесь к текстовому протоколу для получения дополнительных типов образцов. Затем добавьте один миллилитр GPB на грамм пищи к образцам с шипами и без шипов и используйте пестик для гомогенизации до полного смешивания. Экстраполируйте общий объем двухграммового образца с шипами из приблизительного общего объема образца разбавителя весом 10 граммов.

Затем добавьте один 10-й объем 10-кратного нейтрализационного буфера к 10-граммовому разбавляющему образцу и два грамма купленного образца с шипами в зависимости от их общего объема. Хорошо перемешайте образцы по инверсии, частично осветите оба образца центрифугированием в течение 10 минут при 6000-кратном давлении и четырех градусах Цельсия. Затем немедленно удалите надосадочную жидкость и перенесите в новые пробирки с помощью бота образец с шипами в качестве образца D и образец без шипов в качестве разбавителя сгенерируйте оставшиеся стандартные образцы кривой в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 миллилитра.

Для приготовления твердых образцов пищи начните с взвешивания двух плюс-минус 0,01 грамма твердого неизвестного образца в коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Добавьте два миллилитра ГПБ и с помощью пестика гомогенизируйте образец. Затем добавьте в образец одну 10-ю объема 10-кратного нейтрализационного буфера и хорошо перемешайте методом инверсии, частично осветлив образец центрифугированием в течение 10 минут при 6000-кратном течении силы тяжести и четырех градусах Цельсия, немедленно перенесите не менее 750 микролитров надосадочной жидкости в микроцентрифужную пробирку.

Это неизвестное разбавление первое. Добавьте 675 микролитров разбавителя в две пробирки с надписью «неизвестное разведение два» и «три». Разбавитель будет представлять собой тот же обработанный материал, который используется для создания стандартной кривой.

Используйте разведение один для последовательного разведения, переливая 75 микролитров разведения один в пробирку для разведения два и смешивая. Затем переложите 75 микролитров разведения два в трехобразный раствор и перемешайте. Чтобы уточнить образцы, центрифугируйте их в течение пяти минут не менее 14 000 раз. Гравитация.

Немедленно удалите надосадочную жидкость и переложите в новые пробирки, чтобы установить планшет для образцов, добавьте по 20 микролитров 10 x связывающего буфера в каждую лунку каждого неизвестного образца, и стандартные изогнутые образцы от D от одного до D восемь требуют трех лунок, а образец D девять требует шести лунок. Добавьте по 200 микролитров каждого образца в соответствующие лунки и с помощью миксера для микропланшетов перемешайте пластину в течение 10 секунд. Делайте бусины изопропилового спирта вихревыми в течение 10 секунд на максимальной скорости или до полного ресуспензирования.

Затем внесите пипеткой по 20 микролитров шариков в каждую лунку для образца и перемешайте пластину в течение 30 секунд. Инкубируйте планшет в инкубаторе с вращающимися пластинами в течение двух часов при 750 об/мин и 25 градусах Цельсия или комнатной температуре, чтобы вымыть планшет с помощью автоматической мойки планшетов. После запуска программы прайма поместите пластину на 96-луночную магнитную пластину для разделения шариков на шайбе для пластин.

Затем запустите основную программу стирки. Когда программа будет завершена, снимите пластину с шайбы. Добавьте 50 микролитров одного реакционного буфера в каждую лунку для образца и перемешивайте в течение 30 секунд.

Чтобы начать тест-матричный анализ бота, добавьте 50 микролитров 0,5 микромолярного репортера AE. В каждую пробную лунку для предотвращения краевых эффектов добавьте 100 микролитров воды на каждую неиспользованную. Используйте потолочную ленту для герметизации пластины, защитите ее от света и инкубируйте при 750 оборотах в минуту и 25 градусах Цельсия или комнатной температуре.

При каждом считывании времени вынимайте пластину из инкубатора. Снимите потолочную ленту и сразу же поместите пластину на 96 лунку магнитной пластины для разделения шариков, дайте шарикам разойтись в течение двух минут. Поместите планшет в считыватель микропланшетов и измерьте излучение на частоте около 470 и около 526 нанометров при возбуждении на глубине около 434 нанометров.

Если требуется дополнительное время считывания, после подвешивания шариков на 30 секунд на микропланшетном миксере снова запечатайте пластину и верните ее в инкубатор. Здесь показаны результаты анализа: с помощью бота голоин был введен в PBS и протестирован после двух-, четырех- и 24-часовой инкубации с репортером AE. Расщепление репортера ботом измеряется как уменьшение коэффициента излучения, измеренного нашим считывателем пластин, примерно с 2,7 для неповрежденного репортера до примерно 0,7 для полностью расщепленного репортера.

Конкретные значения будут отличаться между считывателями пластин, что видно по сдвигу кривой влево, увеличение времени инкубации с репортером приводит к увеличению расщепления репортера. Проверенные в трех экземплярах точки данных демонстрируют низкое стандартное отклонение от среднего значения и следуют ожидаемой тенденции увеличения коэффициента выбросов при снижении токсинной нагрузки. Несоответствие анализа этой ожидаемой тенденции может указывать на ошибку во время разведения, генерации или построения графиков данных: коэффициенты излучения контрольной группы, не содержащей бота А, также остаются стабильными во время инкубации, что указывает на отсутствие неспецифической активности протеазы.

На этом рисунке показана общая методология, используемая для обнаружения или количественного определения любого неизвестного образца по стандартной кривой и количественному определению образцов фармацевтического бота. Стандартная кривая была сгенерирована в PBS с помощью очищенного бота, голотоина и обработана параллельно с разведениями лекарственного препарата, полученного из одного флакона объемом 100 единиц лиофилизированного ботокса, регидратированного в 0,9% физиологического раствора. Концентрации трех неизвестных, попадающих в этот линейный диапазон, были затем интерполированы из стандартной кривой.

В этом эксперименте свежие помидоры и 2%-ное молоко использовались в качестве твердых и жидких пищевых матриц и были приправлены ботом-комплексом, состоящим из основных белков, связанных с холло, тоином и нейротоксином. Эта комбинация была выбрана, потому что она похожа на токсин, вырабатываемый при естественном загрязнении клостридиями, как показано здесь. Восстановление бота А наблюдается с обеими матрицами.

Кроме того, увеличение времени инкубации с репортером повышает чувствительность анализа, но не приводит к снижению коэффициентов эмиссии для контрольной группы без токсинов, что указывает на наблюдаемые результаты расщепления от бота А, а не на перенос неспецифической протеазы из пищи в анализе. В этой таблице приведены значения A-L-O-D-L-O-Q и EC 50 для обоих продуктов в каждый показанный момент времени. LOD и LOQ определяются как образец с наименьшей концентрацией с коэффициентом выбросов ниже трех и 10 стандартных отклонений ниже фона соответственно.

Ожидается некоторая матричная вариабельность LOD и LOQ, поскольку матричные эффекты могут влиять на связывание токсина с шариками и восстановление гранул во время стирки. Несмотря на то, что из 2%-ного молока можно предположить большее извлечение токсинов, чем из помидоров, большая часть этой разницы является результатом дополнительного разбавления, необходимого для гомогенизации образцов томатов в GPB. Помимо того, что помидоры являются твердой пищевой матрицей, они являются заслуживающим внимания типом образцов, где регулировка pH и ионной силы имеет решающее значение для успеха анализа.

На этом рисунке показаны ответы анализа при тестировании томатов с включением или без включения 10-кратного нейтрализующего буфера. Недобавление буфера приводит к плохому извлечению бота А из образцов и проявляется в постоянном соотношении эмиссии по всем тестируемым концентрациям бота А при добавлении 10-кратного нейтрализующего буфера, однако приводит к обнаружению чувствительных токсинов, неспецифические протеазы могут быть эндогенными в образце пищевого продукта или вводиться при использовании неочищенных препаратов бота, таких как культура клостридий. надосадочной жидкости, и может расщепить репортера НЯ, что приведет к ложноположительным результатам. Этот пример демонстрирует неспецифическую активность протеазы, обнаруженную у бота Clostridium и супернатанта культуры с использованием модифицированного репортера, который больше не расщепляется ботом А. Высокие уровни расщепления репортера указывают на культуру.

Надосадочная жидкость содержит значительную активность протеазы, которая эффективно сводится на нет добавлением ингибиторов протеазы. После освоения этого метода общее время анализа может составлять от четырех до 26 часов, в зависимости от типа образца и токсинной нагрузки. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как выделять и количественно определять ботулинический нейротоксин из сложных образцов с помощью иммунопреципитации в системе флуоресцентного белкового репортера.

Не забывайте, что работа с ботулотоксинами может быть чрезвычайно опасной, поэтому при выполнении этой процедуры следует использовать такие меры предосторожности, как перчатки, лабораторные коды и шкафы химической и биологической безопасности.