Выделение и количественная оценка ботулинического нейротоксина Из комплексных матриц с использованием BoTest Matrix Анализы

Общая цель данной процедуры — количественное определение протеолитической активности нейротоксина ботулизма в сложных матрицах, таких как фармацевтические, экологические и пищевые образцы. Это достигается путем предварительной обработки проб и образцов для построения стандартной кривой, если это необходимо, для установления подходящих условий pH и вязкости. Затем нейротоксин ботулизма иммунопреципитируют из образцов с использованием магнитных частиц, покрытых антителами.

Затем магнитные частицы тщательно промывают для удаления любых мешающих соединений и ресуспендируют в оптимизированном реакционном буфере. Наконец, промытые частицы инкубируют с белковым репортером и спектроскопически измеряют расщепление репортера с течением времени. В конечном итоге сравнение расщепления репортера в исследуемых образцах с образцами стандартной кривой используется для количественного определения активности ботулотоксина в исследуемых образцах с чувствительностью, близкой к чувствительности биоанализа на мышах.

Основными преимуществами данного метода по сравнению с другими, такими как анализ на мышах, биологический анализ, иммунологические и другие флуоресцентные методы, являются отсутствие необходимости в использовании животных и доказанная эффективность применения в крайне сложных матрицах, характерных для пищевых, экологических и фармацевтических образцов. Как правило, специалисты, впервые использующие данный метод, могут столкнуться с трудностями, поскольку требуется тщательная подготовка и разведение образцов. Процедуру продемонстрирует доктор Марк Даннинг, ученый из Bio Sentinel.

Приготовьте буферы согласно текстовому протоколу для построения стандартной кривой, необходимой для количественного анализа исследуемых образцов. Взвесьте 10 ± 0,01 г твердого пищевого образца в коническую пробирку объемом 50 мл и отложите его; этот образец будет использоваться в качестве разбавителя. В отдельную пробирку взвесьте 2 ± 0,01 г твердого пищевого образца. Добавьте ботулинический нейротоксин (BoNT) на поверхность 2-граммового образца пищи до конечной концентрации 30 000 MLD₅₀ на грамм продукта. Инкубируйте разбавитель и образцы с добавками при комнатной температуре или при 4 °C в течение двух часов, чтобы дать BoNT время взаимодействовать с матрицей продукта.

Для имитации естественного загрязнения обратитесь к текстовому протоколу для ознакомления с дополнительными типами образцов. Затем добавьте один миллилитр GPB на грамм продукта в инокулированные и неинокулированные образцы и с помощью пестика гомогенизируйте смесь до полного смешивания. Рассчитайте общий объем двухграммового инокулированного образца, исходя из приблизительного общего объема образца разбавителя массой 10 грамм.

Затем добавьте 1/10 объема 10-кратного нейтрализующего буфера к 10-граммовой пробе разбавителя и к 2-граммовой обогащенной пробе, исходя из их общего объема. Тщательно перемешайте образцы путем переворачивания, частично осветлите оба образца, центрифугируя их в течение 10 минут при 6 000 ×g и температуре 4 °C. Затем немедленно снимите супернатанты и перенесите их в новые пробирки, используя обогащенную пробу в качестве D1, а пробу разбавителя — в качестве разбавителя; приготовьте остальные образцы для стандартной кривой в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл.

Для подготовки образцов твердой пищи начните с навешивания 2 ± 0,01 г неизвестного твердого образца в коническую пробирку объемом 50 мл. Добавьте 2 мл GPB и с помощью пестика гомогенизируйте образец. Затем добавьте в образец 10-кратный нейтрализационный буфер в объеме 1/10 от общего объема и тщательно перемешайте путем инверсии. После частичного осветления образца путем центрифугирования в течение 10 минут при 6 000 ×g и 4 °C немедленно перенесите не менее 750 µL супернатанта в микроцентрифужную пробирку.

Это неизвестный разведение один. Добавьте 675 µL разбавителя в две пробирки с маркировкой «неизвестное разведение два» и «три». В качестве разбавителя используется тот же обработанный материал, который применялся для построения стандартной кривой.

Используйте первый разведение для приготовления последовательных разведений, перенеся 75 µL первого разведения в пробирку для второго разведения и перемешав. Затем перенесите 75 µL второго разведения в пробирку для третьего разведения и перемешайте. Для осветления образцов центрифугируйте их в течение пяти минут при ускорении не менее 14 000 ×g.

Немедленно удалите супернатанты и перенесите их в новые пробирки для подготовки планшета с образцами; добавьте по 20 µL 10-кратного связывающего буфера в каждую лунку. Для каждого неизвестного образца, а также для образцов стандартной кривой от D1 до D8 требуется по три лунки, а для образца D9 — шесть лунок. Добавьте по 200 µL каждого образца в соответствующие лунки и перемешайте планшет на шейкере для микропланшетов в течение 10 секунд. Вортексируйте биссератные частицы IPA в течение 10 секунд на максимальной скорости или до полного ресуспендирования.

Затем перенесите пипеткой 20 µL магнитных частиц в каждую лунку с образцом и перемешайте планшет в течение 30 секунд. Инкубируйте планшет в ротационном инкубаторе в течение двух часов при 750 RPM и 25 °C или при комнатной температуре, после чего промойте планшет с помощью автоматического мойщика планшетов. После запуска программы подготовки (prime program) поместите планшет на 96-луночную магнитную платформу для сепарации частиц в мойщике планшетов.

Затем запустите основную программу промывки. По завершении программы извлеките планшет из промывочного устройства. Добавьте по 50 µL 1x реакционного буфера в каждую лунку с образцом и перемешайте в течение 30 секунд.

Для начала анализа по матрице бот-теста добавьте 50 µL 0,5 µM AE-репортера в каждую лунку с образцом. Чтобы предотвратить краевые эффекты, добавьте по 100 µL воды в каждую неиспользуемую лунку. Запечатайте планшет специальной лентой для запечатывания, защитите его от света и инкубируйте при 750 RPM и 25 °C или при комнатной температуре.

При каждом измерении извлекайте планшет из инкубатора. Снимите верхнюю герметизирующую ленту и немедленно поместите планшет на магнитную подставку для разделения магнитных частиц в 96-луночном формате; дайте частицам отстояться в течение двух минут. Поместите планшет в микропланшетный ридер и измерьте интенсивность эмиссии при длинах волн примерно 470 и 526 нм при возбуждении при длине волны примерно 434 нм.

Если требуются дополнительные замеры, после повторного суспендирования гранул в течение 30 секунд на миксере для микропланшетов снова закройте планшет и верните его в инкубатор. Здесь представлены результаты анализа с использованием bot, который был добавлен в PBS и протестирован после двух, четырех и 24-часовых инкубаций с репортером AE. Расщепление репортера белком bot измеряется как снижение соотношения эмиссии, определяемого нашим планшетным ридером, примерно от 2.7 для неповрежденного репортера до около 0.7 для полностью расщепленного репортера.

Конкретные значения будут различаться в зависимости от используемого планшетного ридера, что видно по смещению кривой влево; более длительное время инкубации с репортером приводит к увеличению расщепления репортера. Точки данных, протестированные в трех повторностях, демонстрируют низкое стандартное отклонение среднего и следуют ожидаемой тенденции увеличения соотношения эмиссии при снижении нагрузки токсина. Отсутствие данной тенденции в анализе может указывать на ошибку при подготовке разведений или построении графиков данных; соотношения эмиссии контролей, не содержащих ботулотоксина A, также остаются стабильными в течение инкубации, что свидетельствует об отсутствии неспецифической протеазной активности.

На данном рисунке представлена общая методика, используемая для обнаружения или количественного определения любого неизвестного образца по калибровочной кривой, а также количественное определение образцов фармацевтического препарата bot a. Калибровочная кривая была построена в PBS с использованием очищенного bot, a holo toin, и обрабатывалась параллельно с разведениями лекарственного препарата, полученными из одного флакона с 100 единицами лиофилизированного Botox, регидратированного в 0,9% физиологическом растворе; в данном анализе линейный участок калибровочной кривой находится в диапазоне отношений эмиссии от 2,11 до 1,05 и отмечен на рисунке пунктирной рамкой. Затем концентрации трех неизвестных образцов, попавших в этот линейный диапазон, были интерполированы по калибровочной кривой.

В данном эксперименте в качестве твердой и жидкой пищевых матриц использовали свежие томаты и 2% молоко, в которые вносили ботулотоксин A, представляющий собой комплекс, состоящий из основных белков — холло-, нейротоксина и ассоциированных белков. Данная комбинация была выбрана, так как она соответствует токсину, вырабатываемому при естественном загрязнении Clostridium, как показано здесь. Выделение ботулотоксина A наблюдалось в обеих матрицах.

Кроме того, увеличение времени инкубации с репортером повышает чувствительность анализа, но не приводит к снижению коэффициентов эмиссии для контролей без токсина, что указывает на то, что наблюдаемое расщепление вызвано bot A, а не переносом неспецифических протеаз из пищевых продуктов в анализ. Значения bot A-L-O-D-L-OQ и EC 50 для обоих пищевых продуктов в каждой из представленных временных точек обобщены в данной таблице. LOD и LOQ определены как образец с наименьшей концентрацией, имеющий коэффициент эмиссии ниже трех и на 10 стандартных отклонений ниже фонового значения соответственно.

Ожидается определенная вариабельность значений LOD и LOQ в зависимости от матрицы, так как матричные эффекты могут влиять на связывание токсина с микросферами и степень извлечения микросфер в процессе промывки. Хотя данные свидетельствуют о более высоком выходе токсина из 2% молока, чем из томатов, большая часть этой разницы обусловлена дополнительным разбавлением, необходимым для гомогенизации образцов томатов в GPB. Помимо того, что томаты являются твердой пищевой матрицей, они представляют собой особый тип образца, в котором корректировка pH и ионной силы имеет решающее значение для успешного проведения анализа.

На этом рисунке показаны результаты анализа при тестировании томатов с добавлением и без добавления 10-кратного нейтрализующего буфера. Отсутствие буфера приводит к низкому выходу ботулотоксина A из образцов, что проявляется в виде постоянного отношения эмиссии при всех протестированных концентрациях ботулотоксина A; однако добавление 10-кратного нейтрализующего буфера обеспечивает чувствительное обнаружение токсина. Неспецифические протеазы могут быть эндогенными для пищевого образца или попадать в него при использовании неочищенных препаратов ботулотоксина, таких как культура Clostridium и супернатанты, и могут расщеплять репортер AE, что приводит к ложноположительным результатам. Данный пример демонстрирует активность неспецифических протеаз, обнаруженных в супернатантах культур Clostridium bot a, с использованием модифицированного репортера, который больше не расщепляется ботулотоксином A. Высокие уровни расщепления репортера указывают на культуру.

Супернатант обладает значительной протеазной активностью, которая эффективно подавляется путем добавления ингибиторов протеаз. После освоения данной методики общее время проведения анализа может составлять от 4 до 26 часов, в зависимости от типа образца и содержания токсина. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выделять и количественно определять ботулинический нейротоксин из сложных образцов с помощью иммунопреципитации в флуоресцентной белковой репортерной системе.

Не забывайте, что работа с ботулиническими нейротоксинами может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование перчаток, лабораторных халатов, а также работа в шкафах химической и биологической безопасности.