Создание Геном человека-редакцией плюрипотентных стволовых клеток: От Ориентация в изоляцию

Общая цель этой процедуры заключается в генной инженерии плюрипотентных стволовых клеток человека с использованием современных технологий редактирования генома. Хотя эта процедура может дать представление о биологии стволовых клеток, она также может быть применена для облегчения моделирования заболеваний человека в генетически определенных условиях. Как правило, особи, плохо знакомые с этим методом, должны будут попрактиковаться в изоляции колоний, прежде чем стать опытными.

Визуальная демонстрация этого метода имеет важное значение, так как идентификация и отбор колоний могут быть затруднены. Начните с культивирования человеческих плюрипотентных стволовых клеток в среде hESC на шестилуночном планшете, содержащем инактивированные митомицин С эмбриональные фибробласты мышей или фидерные клетки MEF, выращенные на желатине. Каждый последующий день после нанесения покрытия, пока hPSCs не достигнет 50% конфлюенции, используйте стеклянную пипетку и вакуумируйте для удаления всего объема среды.

Замените на три миллилитра теплой среды hESC на лунку. За сутки до нацеливания удалите среду hESC и добавьте свежую предварительно подогретую среду hESC с добавлением 10 микромоляров Y-27632. Кроме того, приготовьте от одного до двух шестилуночных планшетов с лекарственно-устойчивыми фидерными клетками MEF от мышей DR4.

В день нацеливания приготовьте трансвекционные растворы, пипетируя пять микрограммов плазмиды экспрессии 1 и 2 нуклеазы цинкового пальца, плазмиды экспрессии TALON 1 и 2 или 15 микрограммов плазмиды CRISPR cas9 px330, кодирующей плазмиду объемом пять десятых, в пробирку объемом пять целых 5 миллилитров. Добавьте 30 микрограммов восстановленной донорской плазмиды, а затем достаточное количество фосфатного буферного раствора, чтобы довести объем до 300 микролитров. Осмотрите клетки под микроскопом, чтобы убедиться в 50% конфлюенции.

Далее с помощью стеклянной пипетки пылесосом удалите среду с пластины hPFCs, затем промойте клетки 2 миллилитрами теплого 1x PBS. После аспирации PBS добавьте ноль целых пять десятых миллиметра 0,25% раствора трипсина-ЭДТА непосредственно на клетки. Поместите в инкубатор для тканевых культур примерно на 10 минут или до тех пор, пока питательный слой не начнет отрываться от пластины.

После инкубации добавьте в каждую лунку по два миллилитра теплой промывочной среды, чтобы остановить реакцию трипсина. Соберите ячейки из каждой лунки, следя за тем, чтобы подающие ячейки оторвались как лист. Пипеткой наденьте содержимое каждой лунки в одну коническую пробирку объемом 50 миллилитров, объединив все лунки, и растирайте клетки с помощью серологической пипетки объемом 10 миллилитров.

Добавьте промывочный материал ES, чтобы довести суспензию ячейки до 40 миллилитров. Подождите одну-две минуты, чтобы большие куски кормушки осядли на дне пробирки, затем удалите надосадочную жидкость с помощью серологической пипетки и положите ее в свежую коническую пробирку объемом 50 миллилитров. После центрифугирования клеточной суспензии в течение пяти минут при 190-кратном g, аспирируйте надосадочную жидкость, не нарушая клеточную палитру.

Ресуспендируйте клетки в 500 микролитрах 1x pbs. Совместите ресуспендированные клетки с приготовленным ранее раствором для пересечения плазмы. Пипеткой соедините клетки и трансфективную смесь в четырехмиллиметровую электропорационную кювету и положите на лед на три-пять минут.

Установите параметры экспоненциальной программы на системе электропорации на 250 вольт, 500 микрофарад, бесконечное сопротивление и размер кюветы четыре миллиметра. Электропорируйте клетки, а затем поместите кювету обратно на лед на три минуты. Ресуспендируйте электропорированные элементы в 18 миллилитрах теплой среды hESC с добавлением 10 микромоляров Y-27632.

Осмотрите DR4 MEF под микроскопом. Поместите три миллилитра одноклеточной суспензии в каждую лунку шестилуночного планшета, содержащего питающие клетки DR4, и верните в инкубатор. На третий день после нанесения покрытия замените среду на элементах hESC без Y-27632.

На четвертый день замените невосполненную среду средой, содержащей соответствующий антибиотик выбора. Здесь используется пуромицин. За день до сбора колонии подготовьте одну 12-луночную пластину с питательными клетками MEF для каждой колонии, которую нужно собрать.

На 12 день после нанесения покрытия осмотрите пластину под микроскопом вскрытия. Определите колонии диаметром от 800 до 1 200 микрон, готовые к сбору. Убедитесь, что эти колонии не содержат клеток, которые начинают дифференцироваться, как показано здесь.

Кроме того, убедитесь, что клетки экспрессируют GFP. В день сбора осмотрите MEF под микроскопом, чтобы убедиться, что они здоровы. Удалите все среды с ячеечных пластин питателя MEF и замените их одним миллилитром среды hESC.

Кроме того, замените среду hESC на шестилуночных планшетах hPSC, которые будут выбраны. Далее вытяните стеклянные пипетки для сбора колоний. Чтобы захватить колонии, сначала поместите пластинчатые hPFC на столик диссекционного микроскопа в вытяжном шкафу для культуры тканей, соберите устройство для сбора данных, поместив стеклянный конец пипетки в всасывающую колбу.

Определите колонию, которую нужно собрать, и поместите кончик стеклянной пипетки над колонией. Затем сожмите луковицу с помощью устройства для сбора, аккуратно вырезайте и разрежьте и разрежьте отдельную колонию на 10-20 одинаковых по размеру частей. Далее втяните вырезанные кусочки колонии в пипетку, освободив колбу.

Старайтесь брать как можно меньше носителей при переносе. Сожмите луковицу, чтобы перенести теперь уже разрушенную колонию непосредственно в одну лунку 12-луночной ячеистой пластины питателя MEF. Пометьте каждую лунку, чтобы обеспечить уникальную идентификацию клонов, полученных из отдельных клеток.

Поменяйте стеклянную пипетку и повторите процедуру для следующей колонии. Верните пластины в инкубатор, и осторожно покачивайте пластины, чтобы разогнать клетки в лунке. На следующий день удалите весь объем среды, и замените на одну целую пять миллилитров теплой среды.

Повторяйте в течение 10–12 дней, пока клетки не слились на 50%. Через 10–12 дней проверьте hESCs под зондом. Выберите одну-две колонии из каждой лунки и перенесите их на новые 12-луночные фидерные клеточные планшеты MEF, чтобы создать точную точную пластину.

Извлеките ДНК из оставшихся колоний в каждой лунке исходных планшетов для генотипирования методом ПЦР или южного блоттинга. Вебер: Три человеческие эмбриональные стволовые клетки были нацелены на локус AAVS1 с использованием сайт-специфических нуклеаз и шаблона репарации для введения репортера EFFP и кассеты с устойчивостью к пуромицину. На этих репрезентативных изображениях показаны колонии, отредактированные нуклеазами цинковых пальцев, TALEN и CRISPR/Cas9.

Эти репрезентативные результаты генотипирования ПЦР показывают нецелевые, гетерозиготные и гомозиготные целевые клоны с использованием нуклеаз цинковых пальцев, TALEN и CRISPR/Cas9 наряду с контролем дикого типа. В этой таблице показаны ПЦР-верифицированные интеграции в локусе AAVS1 для каждой сайт-специфической нуклеазы в этом эксперименте по сравнению с правильными одиночными интеграциями, проверенными методом Саузерн-блоттинг в предыдущих экспериментах. CRISPR-Cas9 дал наиболее правильно нацеленные клоны, в то время как платформа TALEN имела наиболее гомозигально нацеленные клоны.

После освоения этой техники требуется от трех до пяти часов практического времени, и вы можете получить отредактированные клетки примерно через три недели после начала экспериментов. При использовании этой техники очень важно работать безопасно и всегда использовать стерильную технику. После генетической манипуляции вы можете увидеть, как это влияет на другие типы клеток, используя дифференцировку стволовых клеток в другие типы клеток, такие как нейроны.

Разработка этого протокола открыла исследователям путь к использованию редактирования генома в плюрипотентных стволовых клетках человека для создания моделей заболеваний in vitro. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как редактировать геном в плюрипотентных стволовых клетках человека.