Выделение и функциональная характеристика человека желудочка кардиомиоцитов из свежих хирургических образцов

Общая цель этой процедуры заключается в выделении жизнеспособных кардиомиоцитов из патологических образцов желудочков человека и характеристике их функциональных изменений. Это достигается путем быстрого сбора и измельчения свежих образцов желудочков в ледяном кардиоплегическом растворе, чтобы избежать чрезмерной деградации тканей и повреждения клеток. Вторым шагом является поэтапное сбраживание кусочков миокарда с использованием специально изготовленного устройства для разложения и ферментативных растворов.

В течение шести циклов клетка, содержащая буфер, собирается в пробирку на каждом цикле и разбавляется раствором, сохраняющим клетки. Заключительным этапом является ресуспендирование клеток, содержащихся в шести пробирках, в меньшем объеме стандартного физиологического раствора с нормальными концентрациями кальция для выполнения функциональной характеристики. В конечном счете, запись потенциалов действия с помощью пластыря и одновременная оценка межклеточного кальция с использованием флуоресцентных красителей используются для демонстрации изменений действия, потенциальной продолжительности и внутриклеточного цикла кальция в кардиомиоцитах у пациентов с гипертрофической кардиомиопатией.

Основное преимущество DYS по сравнению с 16 методом, как и стандартный метод дефолирования кусков, заключается в том, что в ассоциации с ферментным раствором мы используем специально изготовленное устройство для разложения, которое позволяет совместно деассоциировать вариабельные циты благодаря его кремниевым соскобам. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области кардиологии, например, как хорошо известное молекулярное и структурное ремоделирование, связанное с сердечными заболеваниями, отражается на изменении отдельных кардиомиоцитов, которые могут быть проанализированы с помощью нашего метода и нацелены на конкретные препараты. Таким образом, применение этого метода распространяется на терапию генетических сердечных заболеваний, таких как гипертрофическая кардиомиопатия.

Фактически, этот метод может быть использован для тестирования новых нейропатических подходов на желудочковых кардиомиоцитах пациентов с гипертрофическими или ишемическими заболеваниями сердца, перенесших операцию на сердце. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы сравнивали аналогию между образцами человеческих артерий и биопсией желудочков, полученными во время кардиохирургии. Начните эту процедуру с того, что налейте 40 миллилитров раствора Cardioplegic в 50-миллилитровую пробирку и храните ее во льду для транспортировки образца из операционной в лабораторию изоляции клеток, быстро перенесите образец в лабораторную зону и начните обработку образца в течение 10 минут после его иссечения.

Следующий коллективный забор миокарда желудочков из операционной сразу после иссечения. Промойте его ледяным раствором CP и храните в пробирке, держа образец в ледяном буфере CP. После этого аккуратно удалите эндокардиальный фиброзный слой с помощью тонких ножниц.

Разрежьте ткань миокарда на небольшие кусочки длиной два-три миллиметра с общим количеством миокарда желудочков от 100 миллиграммов до одного грамма на каждую изоляцию. После того, как куски будут перенесены в скребковую камеру устройства для сбраживания, замените CP-буфер в камере на холодный буфер диссоциации без кальция. Затем поместите устройство для сбивания в термостатическую ванну.

Установите ванну на 37,5 градусов Цельсия и включите ее. Далее включите мотор устройства для сбраживания и установите скорость вращения на один оборот в секунду. Выполните три цикла промывки с DB и меняйте раствор в камере с температурой 37 градусов Цельсия, насыщенном кислородом, очищайте DB каждые восемь минут.

После этого приготовьте ферментный буфер один, добавив 250 единиц на миллилитр коллагеназы типа пять и четыре единицы на миллилитр протеазы. Тип 24 к решению БД. Затем приготовьте ферментный буфер два, добавив 250 единиц на миллилитр коллагеназы.

Тип пять к раствору ДБ насыщают кислородом ЭБ один, и прогревают его до 37 градусов Цельсия. Затем выполните два 12-минутных цикла сбраживания во вращающемся устройстве для сбраживания с тремя миллилитрами 100% насыщенного кислородом EB при температуре 37 градусов Цельсия. Удаляйте раствор с помощью аспирации пипеткой и выбрасывайте его после каждого цикла.

Далее приготовьте шесть 15-миллилитровых пробирок для сбора клеток и 80 миллилитров четырехградусного раствора крафтового заваривания для ускользающих буферов насыщения кислородом EB two и обработайте его до 37 градусов Цельсия. Затем выполните первый 15-минутный цикл пищеварения с тремя миллилитрами 100% насыщенного кислородом БЭ двумя при температуре 37 градусов Цельсия. После цикла разложения соберите раствор, содержащий первые ассоциированные миоциты, в пробирку объемом 15 миллилитров и разведите клеточную суспензию 12 миллилитрами холодного раствора KB.

Храните пробирку в горизонтальном положении при комнатной температуре, выполните пять других 12-минутных циклов пищеварения с тремя миллилитрами EB, два при 37 градусах Цельсия и собирайте буфер, содержащий миоциты, на каждом цикле в 15-миллилитровую коническую пробирку. Не забывайте также разбавлять собранный трехмиллилитровый буфер 12 миллилитрами раствора KB при каждом цикле. В конце храните шесть ячеек, содержащих трубки, при комнатной температуре.

На этом этапе добавьте один миллиграмм на миллилитр бычьего сывороточного альбумина к 20 миллилитрам буфера без кальция. Затем отфильтровать раствор, затем центрифугировать шесть миоцитов, содержащих конические пробирки при 100 сырах, в течение пяти минут. Чтобы заставить миоциты оседать, удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в каждой пробирке переменным количеством БСА, содержащего ТБ, при комнатной температуре.

Постепенно увеличивайте концентрацию кальция в буфере, содержащем клетку, добавляя небольшие OTTs 100 миллимоляров на литр раствора хлорида кальция на первом и втором этапах. Концентрация кальция повышена до 50 микромоляров на литр и 100 микромоляров на литр соответственно. Следующие этапы добавления кальция выполняются каждые пять минут, и концентрация повышается на 100 микромоляров на литр на каждом этапе до конечной концентрации 0,9 миллимоляра на литр.

Чтобы оценить выход из процедуры выделения, перенесите 0,5 миллилитра раствора, содержащего миоциты, на стеклянную нижнюю камеру микроскопа. Оцените 15 полей микроскопа при 10-кратном увеличении объектива и рассчитайте процент здоровых миоцитов, таких как палочковидные клетки с четкими бороздками и без значительных включений. Ожидаемый выход должен составлять около 20% для демонстрации функциональной оценки кардиомиоцитов человека, включая одновременную регистрацию потенциалов действия и внутриклеточных потоков кальция.

Во-первых, приготовьте раствор пипетки для экспериментов с патч-клэмпингом в конфигурации с перфорированным патчем. Затем добавьте 1,8 миллимоляра хлорида кальция к свободному маточному кладу. Используйте раствор для суперфузии кардиомиоцитов во время экспериментов по флуоресценции пластыря.

Далее перелейте один миллилитр клеточной суспензии в 1,5-миллилитровую пробирку и добавьте 10 микромоляров на литр грип форта и 10 микролитров силовой нагрузки. Концентрат выдерживают в течение 30 минут при комнатной температуре, установив в горизонтальное положение. После этого установите трубку в вертикальное положение и оставьте ячейки отстояться на пять минут.

Затем пипеткой выводят надосадочную жидкость и ресуспендируют клеточную гранулу в кальций, содержащий туберкулез. Перенос точки 25 миллилитров клеточной суспензии в небольшую камеру с контролируемой температурой микроскопа, установленную в регистрирующей камере. Суперсплавленный под действием силы тяжести с системой микрофуэра с подогревом со скоростью расхода 0,3 миллилитра в минуту при 37 градусах Цельсия.

С помощью микродозатора подготовьте патч-клемовые пипетки с диаметром наконечника от трех до пяти микрометров и сопротивлением от трех до 4,5 мега ом при заполнении псом. После этого добавьте в ПС амфотерицин В в дозе 250 микрограмм на миллилитр и используйте его для заполнения электродов, после чего закрепите электрод на держателе пипетки. Далее выберите ячейку в форме Рона с четкими бороздками и без включений.

Сформируйте гига-уплотнение и подождите от пяти до 10 минут, пока сопротивление доступа не упадет ниже 20 Ом. В дальнейшем выявляйте потенциалы действия в режиме тока-зажима с помощью коротких импульсов при различных частотах стимуляции. Во время фазы записи включите яркое освещение поля на 492 нанометра и определите флуоресценцию Fluor и флуоресценцию на глубине от 505 до 520 нанометров.

Затем получают сигналы флуоресценции и мембранного потенциала. На этом рисунке показаны изменения потенциалов действия в желудочковых кардиомиоцитах из образцов ГКМП. Ниже приведены репрезентативные наложенные потенциалы действия, возникающие при частоте 0,2 герц, 0,5 герц и одном герце от контрольного миоцита и миоцита ГКМП.

Накладываются потенциалы действия на частоте 0,5 герц от контрольного миоцита. Показано отсутствие и присутствие от 10 до 7 молярных изопротеренолов, и вот репрезентативный след мембранного потенциала кардиомиоцита у пациента с ГКМП, у которого наблюдалось несколько спонтанных деполяризаций вскоре после деполяризации. На рисунке показаны изменения транзиентного кальция в желудочковых кардиомиоцитах из образцов ГКМП.

Ниже приведены репрезентативные наложенные переходные процессы кальция, вызванные во время стимуляции с частотой 0,2 герц через патч-пипетку в контрольном миоците и клетке ГКМП. Показана кинетика кальциевых переходных процессов в ГКМП и контрольных кардиомиоцитах в разное время, и здесь представлены репрезентативные длинные следы, показывающие внутриклеточный кальций во время стимуляции на трех различных частотах, что подчеркивает повышенное диастолическое содержание кальция при высоких скоростях стимуляции в миоцитах ГКМП. На этом рисунке показаны дополнительные экспериментальные применения с использованием миоцитов желудочков человека.

Репрезентативные наложенные кривые, показывающие кальциевый ток L-типа, зарегистрированный при различных напряжениях мембраны, показаны слева, а средняя пиковая плотность кальциевого тока L-типа от 18 клеток, выделенных из образцов HCM при различных напряжениях мембраны, показана здесь, а здесь показана внутриклеточная кальциевая трасса, зарегистрированная из миоцита желудочков во время стимуляции электрическим полем на частоте в один герц. При попытке проведения этой процедуры важно помнить о начале процедуры вскоре после забора образца из операционной, чтобы обеспечить выделение кардиомиоцитов желудочков желудка человека после этой процедуры. Можно использовать и другие методы, такие как конфокальная микроскопия образа жизни или иммунохимия, и это будет иметь решающее значение для ответа на фундаментальные вопросы, такие как, например, как нарушение субклеточной локализации мембранных структур и единиц высвобождения кальция при сердечных заболеваниях после их развития.

Этот метод проложил путь в клеточной кардиологии к изучению функциональных аномалий в желудочковых кардиомиоцитах и проверке потенциальной полезности новых терапевтических вариантов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделить жизнеспособные одиночные кардиомиоциты из образцов человека и как охарактеризовать функцию клетки в различных условиях.