Выделение и функциональная характеристика человека желудочка кардиомиоцитов из свежих хирургических образцов

Общая цель данной процедуры заключается в выделении жизнеспособных кардиомиоцитов из патологически измененных образцов желудочков сердца человека и определении их функциональных изменений. Для этого сначала осуществляется быстрый сбор и измельчение свежих образцов желудочков в ледяном кардиоплегическом растворе, чтобы избежать избыточной деградации тканей и повреждения клеток. На втором этапе проводится пошаговое переваривание фрагментов миокарда с использованием специально разработанного устройства для дигестии и ферментативных растворов.

В течение шести циклов содержимое ячейки с буфером собирают в пробирку после каждого цикла и разбавляют раствором для сохранения клеток. Заключительным этапом является ресуспендирование клеток из шести пробирок в меньшем объеме стандартного физиологического раствора с нормальной концентрацией кальция для проведения функциональной характеристики. В конечном итоге для демонстрации изменений потенциала действия, его длительности и внутриклеточного цикла кальция в кардиомиоцитах пациентов с гипертрофической кардиомиопатией используются метод локальной фиксации потенциала (patch clamp) для регистрации потенциалов действия и одновременная оценка содержания межклеточного кальция с помощью флуоресцентных красителей.

Основным преимуществом метода DYS по сравнению с традиционным методом диссоциации тканей, таким как стандартный метод механического измельчения, является то, что в сочетании с ферментным раствором мы используем специально разработанное устройство для диссоциации, которое позволяет проводить совместную диссоциацию различных типов клеток благодаря своим силиконовым скребкам. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области кардиологии, например, как известные молекулярные и структурные изменения, связанные с сердечными заболеваниями, отражаются на изменениях отдельных кардиомиоцитов, которые могут быть проанализированы с помощью нашего метода и станут мишенями для специфических лекарственных препаратов. Таким образом, применение этой методики распространяется на терапию генетических сердечных заболеваний, таких как гипертрофическая кардиомиопатия.

На самом деле, этот метод может быть использован для тестирования новых нейропатических подходов на вентрикулярных кардиомиоцитах пациентов с гипертрофическими или ишемическими заболеваниями сердца, перенесших операцию на сердце. Идея этого метода возникла у нас при сравнении аналогии между образцами человеческих артерий и биоптатами желудочков, полученными во время кардиохирургической операции. Начните выполнение данной процедуры, налив 40 milliliters кардиоплегического раствора в пробирку объемом 50 milliliters; храните ее на льду для транспортировки образца из операционной в лабораторию по изоляции клеток. Быстро переместите образец в лабораторную зону и приступите к его обработке в течение 10 минут после извлечения образца.

Следующий образец миокарда желудочка из операционной сразу после иссечения. Промойте его ледяным раствором CP и поместите в пробирку, сохраняя образец в ледяном буфере CP. Затем осторожно удалите фиброзный слой эндокарда с помощью тонких ножниц.

Нарежьте ткань миокарда на мелкие кусочки длиной от двух до трех миллиметров, используя общее количество желудочкового миокарда от 100 мг до 1 г для каждой изоляции. После переноса фрагментов в камеру для соскребания устройства для дигестии замените буфер CP в камере на холодный буфер для диссоциации, не содержащий кальция. Затем поместите устройство для дигестии в термостатическую баню.

Установите температуру водяной бани на 37.5 °C и включите ее. Затем включите двигатель устройства для переваривания и установите скорость вращения на один оборот в секунду. Выполните три цикла промывки раствором DB, заменяя раствор в камере на чистый насыщенный кислородом DB при температуре 37 °C каждые восемь минут.

После этого приготовьте ферментный буфер 1, добавив к раствору DB 250 ед/мл коллагеназы типа 5 и 4 ед/мл протеазы типа 24. Затем приготовьте ферментный буфер 2, добавив 250 ед/мл коллагеназы.

Добавьте пять единиц раствора DB в оксигенированный EB 1 и подогрейте его до 37 °C. Затем проведите два 12-минутных цикла переваривания в ротационном устройстве для переваривания с использованием 3 мл 100% оксигенированного EB 1 при 37 °C. После каждого цикла удалите раствор путем аспирации пипеткой и утилизируйте его.

Затем подготовьте шесть пробирок объемом 15 мл для сбора клеток и 80 мл раствора для элюирования буферов при температуре 4 °C; насытьте EB 2 кислородом и доведите температуру до 37 °C. Впоследствии проведите первый 15-минутный цикл переваривания с использованием 3 мл 100% насыщенного кислородом EB 2 при 37 °C. После завершения цикла переваривания соберите раствор, содержащий первые ассоциированные миоциты, в пробирку объемом 15 мл и разбавьте клеточную суспензию 12 мл холодного раствора KB.

Храните пробирку в горизонтальном положении при комнатной температуре, проведите еще пять 12-минутных циклов расщепления с использованием 3 мл EB при 37 °C и собирайте буфер, содержащий миоциты, после каждого цикла в коническую пробирку объемом 15 мл. Не забудьте также разбавлять собранные 3 мл буфера 12 мл раствора KB в каждом цикле. В конце храните шесть пробирок с клетками при комнатной температуре.

На этом этапе добавьте бычий сывороточный альбумин в концентрации 1 mg/mL к 20 mL тиро-буфера без кальция. Затем профильтруйте раствор, после чего центрифугируйте шесть конических пробирок с миоцитами при 100 ×g в течение пяти минут. Чтобы миоциты осадились, удалите супернатант и ресуспендируйте клетки в каждой пробирке определенным количеством TB, содержащего BSA, при комнатной температуре.

Постепенно увеличивайте концентрацию кальция в буфере в кювете, добавляя небольшие объемы 100 mM раствора хлорида кальция на первом и втором этапах. Концентрация кальция повышается до 50 µM и 100 µM соответственно. Последующие этапы добавления кальция выполняются каждые пять минут, при этом на каждом этапе концентрация повышается на 100 µM до конечного значения 0,9 mM.

Для оценки выхода процедуры изоляции перенесите 0,5 milliliters раствора, содержащего миоциты, в камеру с стеклянным дном микроскопа. Оцените 15 полей зрения при 10-кратном увеличении объектива и рассчитайте процент здоровых миоцитов, таких как палочкоподобные клетки с четкими поперечными полосками и отсутствием значимых включений. Ожидаемый выход должен составлять около 20%, чтобы продемонстрировать функциональную оценку кардиомиоцитов человека, включая одновременную регистрацию потенциалов действия и внутриклеточных потоков кальция.

Сначала приготовьте раствор для пипеток для проведения экспериментов методом патч-клампа в конфигурации перфорированного патча. Затем добавьте 1,8 миллимоляр хлорида кальция в кальций-бесплодный tb. Используйте данный раствор для суперфузии кардиомиоцитов во время экспериментов с применением патч-клампа и флуоресценции.

Затем перенесите 1 мл клеточной суспензии в пробирку объемом 1,5 мл, добавьте 10 мкМ/л flu fort и 10 мкл power load. Инкубируйте смесь в течение 30 минут при комнатной температуре в горизонтальном положении. После этого установите пробирку вертикально и дайте клеткам осесть в течение пяти минут.

Затем отберите супернатант пипеткой и ресуспендируйте осадок клеток в tb, содержащем кальций. Перенесите 25 мл клеточной суспензии в небольшую записывающую камеру с температурным контролем, установленную на микроскопе. Осуществляйте перфузию под действием силы тяжести с помощью системы подогрева микроперфузии со скоростью потока 0,3 мл/мин при 37 °C.

С помощью вытягивателя микропипеток подготовьте пипетки для патч-клампа с диаметром кончика от 3 до 5 мкм и сопротивлением от 3 до 4,5 МОм при заполнении раствором PS. После этого добавьте амфотерицин B в PS в концентрации 250 мкг/мл, заполните электроды этим раствором, а затем установите электрод в держатель для пипеток. Затем выберите клетку округлой формы с четкими бороздками и без включений.

Сформируйте гигаомный контакт и подождите от пяти до 10 минут, пока сопротивление доступа не упадет ниже 20 ohm. Затем вызовите потенциалы действия в режиме фиксации тока (current clamp), используя короткие импульсы с различной частотой стимуляции. На этапе записи включите освещение в светлом поле на длине волны 492 нанометров и регистрируйте флуоресценцию Fluor fort в диапазоне от 505 до 520 нанометров.

Затем зарегистрируйте сигналы флуоресценции и мембранного потенциала. На этом рисунке показаны изменения потенциалов действия в вентрикулярных кардиомиоцитах из образцов с ГКМ. Здесь представлены репрезентативные наложенные потенциалы действия, вызванные при частотах 0,2 Гц, 0,5 Гц и 1 Гц в контрольном миоците и миоците с ГКМ.

Наложенные друг на друга потенциалы действия при частоте 0,5 Гц от контрольного миоцита. Показаны результаты в отсутствие и в присутствии 10⁻⁷ М изоопротеренола, а также представлен типичный график мембранного потенциала кардиомиоцита пациента с ГКМ, на котором видны несколько спонтанных деполяризаций — ранних постдеполяризаций. На рисунке показаны изменения транзиента кальция в вентрикулярных кардиомиоцитах из образцов с ГКМ.

Ниже представлены репрезентативные наложенные друг на друга кривые кальциевых транзиентов, вызванных стимуляцией с частотой 0,2 Гц через патч-пипетку в контрольном миоците и клетке с ГКМП. Показана кинетика кальциевых транзиентов в кардиомиоцитах с ГКМП и контрольных кардиомиоцитах в разные моменты времени; также представлены репрезентативные длительные записи внутриклеточного кальция при стимуляции на трех различных частотах, что подчеркивает повышение диастолического уровня кальция при высоких частотах стимуляции в миоците с ГКМП. На данном рисунке продемонстрированы дополнительные варианты экспериментального применения с использованием вентрикулярных миоцитов человека.

Слева представлены репрезентативные наложенные кривые записи кальциевого тока L-типа при различных значениях мембранного потенциала, а справа — средняя пиковая плотность кальциевого тока L-типа, полученная из 18 клеток, выделенных из образцов с ГКМ при различных значениях мембранного потенциала; также здесь приведена кривая изменения внутриклеточного кальция, записанная в вентрикулярном миоците при электростимуляции с частотой 1 Гц. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости приступить к ней вскоре после получения образца из операционной для обеспечения жизнеспособности. Следуйте данной процедуре для выделения кардиомиоцитов желудочков человека. Могут быть применены и другие методы, такие как живая конфокальная микроскопия или иммунохимия, что будет иметь решающее значение для ответа на фундаментальные вопросы, такие как, например, то, как изменяется субклеточная локализация мембранных структур и единиц высвобождения кальция при сердечных заболеваниях после их развития.

Данный метод открыл возможности в клеточной кардиологии для изучения функциональных нарушений в кардиомиоцитах желудочков и тестирования потенциальной эффективности новых терапевтических вариантов. После просмотра этого видео вы должны будете хорошо понимать, как изолировать жизнеспособные единичные кардиомиоциты из образцов тканей человека и как характеризовать функцию клеток при различных условиях.