Humanized мышь моделью для изучения Бактериальные инфекции Ориентация микрососудов

Общая цель этой процедуры заключается в изучении механизмов, с помощью которых бактерии neer meningitis инфицируют кровеносные сосуды человека in vivo. Это достигается путем пересадки человеческой кожи иммунодефицитной мыши, тем самым вводя кожные кровеносные сосуды человека. На втором этапе гуманизированные мыши заражаются бактериями.

Затем инфекции позволяют протекать в течение заранее определенного периода времени. На заключительном этапе берутся образцы крови и тканей для оценки исхода инфекции. В конечном счете, комбинация гистологии, иммунофлюоресценции и анализа крови и тканей используется для изучения прогрессирования инфекции в сосудах человека.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как модели клеточных культур или модели животных, заключается в том, что впервые мы можем наблюдать типичную клиническую патологию, которая имеет место во время этих инфекций. Как можно скорее после сбора очистите поверхность человеческой кожи 70% этанолом, а затем положите ее на хорошо чистую поверхность, желательно под проточный колпак. Затем с помощью дерматома с заданной толщиной отрежьте срезы от 200 до 400 микрометров от верхней части кожи.

Проверьте ломтики на целостность, а затем обрежьте их далее на квадраты два на два сантиметра. Поместите квадраты в PBS, а затем очистите выбритый участок хирургически подготовленной анестезирующей мышью с тяжелым комбинированным иммунодефицитом бежевой мыши возрастом от шести до восьми недель с 70% этанолом. После нанесения местного анестетика на место трансплантата с помощью изогнутых ножниц осторожно удалите поверхностный слой кожи мыши в области, немного меньшей, чем кусочки трансплантата, стараясь не нарушить нижележащую сосудистую систему.

Двигаясь быстро, чтобы избежать пересыхания трансплантата, поместите один из срезов кожи человека на ложе трансплантата, убедившись, что эпидермальная сторона обращена вверх. Выровняйте край ткани и зафиксируйте его тканевым клеем. Затем аккуратно подогнали остальную кожу человека к ложу трансплантата, поместив небольшое количество тканевого клея по каждому краю.

Всегда обрезайте человеческую кожу по размеру, а не увеличивайте ложе для прививки. Убедившись, что каждый угол зафиксирован, очистите участок раствором йода и наложите пластырь плотно, но не плотно стороной подушки на трансплантат, следя за тем, чтобы это не повлияло на дыхание животного, затем зафиксируйте пластырь лейкопластырем и дайте животному восстановиться на теплой поверхности. После пробуждения верните животное в клетку до тех пор, пока не будет введена бактериальная инъекция, повторно инокулируйте ночную культуру планшета в жидкую культуру.

Утром в день заражения, когда бактерии достигнут нужной концентрации, разбавьте клетки до одного умноженного на 10 до седьмого колониеобразующего звена на миллилитр. Затем после обезболивания подтвердите седацию пересаженных мышей пальцем ноги. Сожмите и положите животных на грелку.

Нанесите глазную мазь на глаза животного, а затем ип. Введите каждой мыши восемь миллиграммов человеческого переноса в физиологическом растворе. Затем для каждого животного отрежьте кончик хвоста и намажьте небольшую каплю крови из хвоста на агаровую пластину, чтобы подтвердить, что кровь стерильна до заражения.

Затем введите 100 микролитров бактериальной культуры внутривенно через ретроорбитальную инъекцию. Через несколько минут снова отрежьте конец хвоста и намажьте этот образец крови на свежие агаровые пластины. Чтобы создать колонии крови сразу после заражения, запечатайте хвост тканевым клеем, а затем разбавьте бактериальный инокулюм и распределите его на агаровых пластинах с соответствующими антибиотиками.

Чтобы создать колониеобразующие единицы инокулюма через шесть часов после заражения, возьмите еще небольшое количество крови из каждого из хвостов мыши, а затем разбавьте и наклейте капли крови, как только что было показано, чтобы создать колониеобразующие единицы через шесть часов. Затем инкубируйте все планшеты при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе в течение ночи, чтобы выполнить формирование колонии органов. Подсчет единиц зараженных животных.

Начните с того, что сделайте разрез по средней линии у каждой усыпленной мыши. Затем для каждого животного разрежьте ребро и сделайте надрез в сердце. Используйте стерильный шприц, чтобы извлечь как можно больше крови из сердца и грудной полости, и распределите ее по индивидуальным стерильным пробиркам для каждого образца.

Затем удалите интересующие органы, а затем перенесите кожные трансплантаты и сопутствующие участки кожи мыши на одну стерильную пластину для каждого животного. Дайте собранной крови свернуться в течение 15 минут, а затем раскрутите ее. Затем извлеките плазму из крови и храните ее при температуре минус 80 градусов Цельсия для последующего анализа.

Далее взвесьте гомогенизирующие пробирки, содержащие по 500 микролитров PBS каждая. А затем с помощью стерильной биопсии можно взять четыре миллиметровых образца биопсии из каждой рассеченной ткани. Поместите биопсию по отдельности в гомогенизирующие пробирки с одной двухмиллиметровой бусиной в каждой пробирке, содержащей образец кожи.

Храните оставшиеся ткани в 4% параформальдегиде при температуре 4 градуса Цельсия для микроскопии и взвешивайте гомогенизирующие пробирки, чтобы установить вес биопсии. Затем гомогенизируйте образцы при 6000 об/мин в течение 30 секунд, повторяя гомогенизацию кожи до тех пор, пока гомогенат не станет какашкой. Наконец, распределите клеточные суспензии из каждой пробирки на свежие агаровые планшеты и выращивайте культуры в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе.

Чтобы установить, как колониеобразующая единица органа учитывается в этих репрезентативных результатах. Положительный GFP штамм N-менингита. Использовалась серогруппа С.

Анализы крови показали, что через пять минут после внутривенного введения в среднем 10 на 10 из шести колониеобразующих единиц бактерий в крови циркулировало в среднем от 1,5 до 10 до пятой колониеобразующей единицы на миллилитр. Через шесть часов подсчет в среднем 4,8 умножить на 10 до четвертой колонииобразующей единицы на миллилитр к 24 часам. Среднее количество составило 2,4 умножить на 10 единиц на четвертую колониеобразующую единицу на миллилитр.

Но в этой группе из 10 мышей у пяти не было обнаруживаемых циркулирующих бактерий, в то время как у остальных пяти было относительно высокое количество. Эти столбцы на этих графиках показывают медианные значения для каждой группы КОЕ, взятых из кожи. Образцы показывают, что у большинства мышей наблюдаются значительные изменения в коже человека, в среднем 2,1 раза по 10 до четвертого КОЕ на миллиграмм ткани в течение шести часов и в 4,4 раза по 10 раз до второго КОЕ на миллиграмм ткани в течение 24 часов.

Контралатеральные образцы кожи мышей не показали количества бактерий в течение 24 часов и только очень низкое количество в течение шести часов, что свидетельствует о сильном предпочтении конечного менингита сосудам человека в трансплантированной ткани. В целом, количество бактерий было очень низким или неопределяемым в другом органе, хотя у двух животных было обнаружено количество, которое может коррелировать с высоким числом циркулирующих бактерий. Эта модель также может быть использована для определения роли факторов вирулентности in vivo.

Например, в этом эксперименте использовались штаммы бактерий, у которых отсутствовали функциональные таблетки четвертого типа, а мыши, инфицированные этими мутантными штаммами, не продемонстрировали бактериальной адгезии в трансплантатах кожи человека, что подтверждает решающую роль таблетки четвертого типа I в адгезии in vivo. На этих конфокальных изображениях кожного трансплантата, через два часа после инфицирования, можно наблюдать сосуды человека, окрашенные лектином UEA конъюгированным ромином. Эпидермальная дермальная граница кожи четко идентифицируема, и инфекционный GFP-положительный и менингит могут четко наблюдаться по всем сосудам.

Этот окрашенный h и e трансплантат кожи человека демонстрирует воспаление и сосудистые утечки, а также тромбоз, сосредоточенный в сосудах, близких к эпидермальной границе кожи. Через 24 часа после инфицирования примерно в 30% случаев инфекции бактериальные спайки в коже привели к развитию макроскопически обнаруживаемой пурпуры. Таким образом, разработка этого метода открывает путь для исследователей, занимающихся исследованиями и взаимодействием патогенов хозяина, для изучения механизмов заболеваний в контексте сосудов человека.