Быстрое и эффективное данио рерио Генотипирование Использование ПЦР с высоким разрешением расплава анализа

Общая цель этой процедуры заключается в быстром скрининге различных генотипов, мутаций или трансгенов у рыбок данио. Это достигается путем сначала извлечения ДНК из тонких зажимов, а затем амплификации ДНК с помощью ПЦР. Следующим шагом является денатурация ампликонов ПЦР при одновременной записи кривых расплава, которые анализируются программным обеспечением.

В конечном счете, результаты показывают различимые кривые расплава для различных генотипов. Основное преимущество этой методики перед существующим методом объемной ПЦР с гель-электрофорезом заключается в том, что она чувствительна к однонуклеотидным изменениям, малым введениям, всем делециям, а также является быстрой и надежной методикой. Хотя этот метод может быть использован для быстрого и эффективного генотипирования рыб данио, он также может быть применен к другим системам и модельным организмам, включая клеточные линии, мышей и других животных.

В день приготовления ДНК добавьте в буфер для лизиса свежую протеиназу К в концентрации один миллиграмм на миллилитр. Ткань может быть собрана у взрослой рыбы с помощью тонкого зажима или у эмбриональной рыбы. Сначала обезболите рыбок в растворе Трика.

Подождите, пока жаберные движения замедлятся. Затем выложите рыбу на стопку салфеток и стерильным лезвием бритвы отрежьте небольшой кусочек хвостового плавника длиной около двух-трех миллиметров. Быстро поместите рыбок в маркированный резервуар с пресной водой для восстановления.

Возьмите зажим для плавника со стерильным наконечником для пипетки и перенесите его в пробирку, заполненную 100 микролитрами буфера для лизиса ДНК. Обязательно промаркируйте как аквариум животного, так и пробирку, инкубируйте все собранные ткани не менее четырех часов и до ночи при температуре 55 градусов Цельсия после инкубации. Инактивируйте белок ACE K, нагревая трубки при температуре 95 градусов Цельсия в течение 15 минут.

Эти образцы следует использовать для ПЦР немедленно, но также можно хранить при температуре минус 20 градусов Цельсия до трех месяцев. Проводите ПЦР в 96 или 384 луночном планшете для каждой реакции. Соедините не более одного микролитра ДНК взрослого человека с четырьмя микролитрами светового сканера.

Мастер-смесь, содержащая флуоресцентный зонд и праймеры в конечной концентрации пять пикомоляров каждый. Если ДНК была взята из эмбриона, используйте до трех микролитров. Покройте реакции 30 микролитрами минерального масла, а затем закройте их крышкой.

Далее накройте загруженную ПЦР-пластину оптически прозрачной клеевой пломбой. Теперь оптимизируйте условия цикличности ПЦР. Типичный набор условий начинается с пяти минут плавления.

Затем следует 30 циклов ПЦР с десятью секундами плавления, 25 секундами на коленях и 30 секундами удлинения. Реакция должна закончиться добавлением 32-го плава, а затем остудить до 15 градусов Цельсия. Проанализируйте ПЦР-планшет, поместив его в систему анализа расплава в программном обеспечении.

Настройте температуру и создайте новый файл для хранения данных. Настройте подмножество. Выберите лунки с образцами в нижней левой части экрана.

Выберите нормализованную вкладку, чтобы исключить флуоресцентные варианты. Вручную расположите параллельную двойную линию в областях prem, melt и post melt и нормализуйте сигналы premel и post melt флуоресцентных сигналов всех образцов до единицы и нуля соответственно. Затем выделите генотипы на основе их температуры плавления, сначала выбрав группировку.

Затем выберите автогруппу из списка стандартного выбора. В разделе группировки выберите нормальный или высокий для профилей плавления с одиночными или множественными переходами соответственно. Они находятся в списке выбора чувствительности в разделе группировки.

Теперь выберите вычислительные группы в разделе группировки, а затем перейдите в меню файлов и нажмите кнопку Сохранить, чтобы сохранить результаты. Протокол может быть выполнен в течение одного дня или разделен на несколько дней. При проведении ПЦР температура расплава ампликона зависит от размера и содержания GC, но, как правило, начальная и конечная температуры 60 градусов Цельсия и 95 градусов Цельсия являются подходящими после проведения расплава.

Анализ кривых флуоресцентного расплава обычно требует нормализации вариации различных кривых образца с использованием областей до и после плавления в качестве стандартов. Это улучшает сравнение результатов из разных образцов, в которых вариация флуоресценции связана с незначительными экспериментальными вариациями. Каждая пара температурных линий для нормализации должна располагаться на расстоянии примерно одного градуса Цельсия друг от друга.

Данные могут быть представлены двумя способами: графиком, на котором показаны файлы профилей кривой плавления, или графиком, на котором показан график субтрактивной разницы по сравнению с эталонным образцом после анализа HRMA, могут быть обнаружены мутации или трансгены. Две различные мутации в гене EIF two B five отмечены красной и синей кривыми. Эти мутантные образцы идентифицируются по значительному различию в кривой расплава, форме или изменении флуоресценции по сравнению со стандартными кривыми дикого типа.

Этот пример четырех различных генотипов в одной коллекции эмбрионов иллюстрирует мощь и чувствительность метода. Как только вы освоите эту технику, ее можно будет выполнить менее чем за восемь часов. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как проводить HRMA для эффективного крупномасштабного скрининга генотипов рыбок данио.