Быстрое и эффективное данио рерио Генотипирование Использование ПЦР с высоким разрешением расплава анализа

Общая цель данной процедуры заключается в быстром скрининге различных генотипов, мутаций или трансгенов у zebrafish. Это достигается путем предварительного выделения ДНК из небольших фрагментов тканей (клиппинга) с последующим амплифицированием ДНК с помощью ПЦР. Следующим этапом является денатурация ПЦР-ампликонов с записью кривых плавления, которые затем анализируются с помощью программного обеспечения.

В конечном итоге результаты демонстрируют отчетливые кривые плавления для различных генотипов. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами, такими как гель-электрофорез с ПЦР, является его чувствительность к однонуклеотидным заменам, небольшим инсерциям и делециям, а также высокая скорость и надежность анализа. Хотя данный метод может быть использован для быстрого и эффективного генотипирования данио-рерио, он также применим к другим системам и модельным организмам, включая клеточные линии, мышей и других животных.

В день подготовки ДНК добавьте свежую протеиназу K в лизирующий буфер до концентрации 1 mg/mL. Ткани можно взять у взрослой рыбы с помощью тонкого зажима или у эмбриона рыбы. Сначала анестезируйте рыбу в растворе Trica.

Дождитесь замедления движений жаберных крышек. Затем поместите рыбу на стопку салфеток и с помощью стерильного лезвия отрежьте небольшой фрагмент хвостового плавника длиной примерно два-три миллиметра. Быстро перенесите рыбу в промаркированный резервуар со свежей водой для восстановления.

С помощью стерильного наконечника дозатора захватите фрагмент плавника и перенесите его в пробирку, содержащую 100 µL буфера для лизиса ДНК. Обязательно промаркируйте и аквариум с животным, и пробирку; инкубируйте все собранные ткани не менее четырех часов (допустимо в течение ночи) при 55 °C. После инкубации инактивируйте белок ACE K, нагрев пробирки при 95 °C в течение 15 минут.

Эти образцы следует использовать для ПЦР немедленно, однако их также можно хранить при температуре −20 °C до трех месяцев. Проводите ПЦР в 96- или 384-луночном планшете для каждой реакции. Смешайте не более 1 µL ДНК взрослой особи с 4 µL сканера света.

Мастер-микс, содержащий флуоресцентный зонд и праймеры в конечной концентрации по 5 pM каждый. Если ДНК была выделена из эмбриона, используйте объем до 3 µL. Покройте реакционные смеси 30 µL минерального масла, затем плотно закройте крышки.

Затем закройте заполненную ПЦР-планшету оптически прозрачной адгезивной пленкой. Теперь оптимизируйте условия ПЦР-циклирования. Типичный набор условий начинается с пятиминутного этапа плавления.

Затем следует 30 циклов ПЦР с денатурацией в течение десяти секунд, отжигом в течение 25 секунд и элонгацией в течение 30 секунд. Реакция должна завершиться дополнительным 32-м циклом денатурации с последующим охлаждением до 15 °C. Проанализируйте ПЦР-планшет, поместив его в систему анализа кривых плавления в программном обеспечении.

Установите температуру и создайте новый файл хранения данных. Настройте подмножество. Выберите лунки с образцами в нижней левой части экрана.

Выберите вкладку «normalized», чтобы устранить флуоресцентные вариации. Вручную расположите параллельную двойную линию в областях prem, melt и post melt, и нормализуйте флуоресцентные сигналы всех образцов в областях premel и post melt до единицы и нуля соответственно. Затем определите генотипы на основании их температуры плавления, предварительно выбрав группировку.

Затем выберите «auto group» в стандартном списке выбора. В разделе группировки выберите «normal» или «high» для профилей плавления с одним или несколькими переходами соответственно. Эти параметры находятся в списке выбора чувствительности в разделе группировки.

Теперь выберите вычислительные группы (compute groups) в разделе группировки, затем перейдите в меню «Файл» (file) и нажмите «Сохранить» (save), чтобы сохранить результаты. Протокол можно выполнить в течение одного дня или разделить на этапы в течение нескольких дней. При проведении ПЦР температуры плавления ампликона зависят от его размера и содержания ГЦ-пар, но обычно подходящими являются начальная температура 60 °C и конечная температура 95 °C после завершения процесса плавления.

Анализ кривых плавления флуоресценции обычно требует нормализации вариаций кривых различных образцов с использованием регионов до и после плавления в качестве стандартов. Это улучшает сопоставимость результатов разных образцов, в которых вариация флуоресценции связана с незначительными экспериментальными отклонениями. Каждую пару температурных линий для нормализации следует располагать с интервалом примерно в один градус Цельсия.

Данные могут быть представлены двумя способами: в виде графика с профилями кривых плавления или в виде графика разности (дифференциального графика) по сравнению с контрольным образцом; после проведения анализа HRMA можно обнаружить мутации или трансгены. Две различные мутации в гене EIF2B5 отмечены красной и синей кривыми. Эти мутантные образцы идентифицируются по значительным различиям в форме кривых плавления или изменению флуоресценции по сравнению с кривыми стандартного дикого типа.

Данный пример с четырьмя различными генотипами в одной группе эмбрионов иллюстрирует мощность и чувствительность метода. При должном навыке эта процедура может быть выполнена менее чем за восемь часов. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить HRMA для эффективного крупномасштабного скрининга генотипов zebrafish.