Методы повышения чувствительности с высоким разрешением Melting полиморфизм единичного нуклеотида генотипирования в малярией

Общей целью следующего эксперимента с расплавом с высоким разрешением является повышение чувствительности обнаружения мутантных аллелей, присутствующих в низких концентрациях в отдельных образцах. Это достигается путем предварительной подготовки извлеченной ДНК путем разбавления матрицы до необходимых объемов и концентраций. Вторым этапом является подготовка анализов с асимметричными пропорциями прямого и обратного праймера для увеличения продукта матричного зонда.

После подготовки реакций температура отжига устанавливается между температурами плавления зонда при привязке либо к дикому типу, либо к мутантному шаблону. Заключительным этапом является анализ усиленных продуктов на соответствующей HRM-платформе. В конечном счете, систематическая ошибка амплификации мутантных аллелей и асимметричная ПЦР на основе зондов позволяют более чувствительно обнаруживать сложные мутации SNP при низких концентрациях, присутствующих в образцах.

Эта повышенная чувствительность полезна для надзора за мутациями в популяциях. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как стандартное плавление с высоким разрешением или генотипирование tac man, заключается в том, что она позволяет повысить чувствительность к аллелям, присутствующим в низких концентрациях, а также позволяет генотипировать SNP, расположенные проксимальнее друг к другу в геноме. Тем не менее, этот метод может дать представление о распространении лекарственной устойчивости у малярийного паразита.

Он также может быть применен к другим системам, таким как эпиднадзор за другими типами инфекционных заболеваний, такими как ВИЧ, или обнаружение редких вариантов рака в популяции клеток. Демонстрировать процедуру будет Кейтлин Дарфи. Техник из нашей лаборатории.

Матрицы для плавления с высоким разрешением или HRM получают из образцов plasmodium falciparum, полученных непосредственно из крови пациентов, участвующих в полевых исследованиях. Образцы могут храниться на фильтровальной бумаге, в экспресс-тестах или в виде гранулированных эритроцитов, образцы также могут быть культивированы, адаптированные для выращивания in vitro. Некоторые стандартные лабораторные штаммы для анализа могут быть заказаны в центре исследований малярии, а образцы референсных реагентов могут быть экстрагированы из цельной крови, эритроцитов или фильтровальной бумаги или использованы непосредственно из гранулированных эритроцитов или культуры для прямой амплификации из гранулированных эритроцитов.

Сначала определите количество эритроцитов с помощью микроскопии тонкого мазка в соответствии с процедурой Центров по контролю и профилактике заболеваний. Затем красные кровяные тельца с содержанием выше 0,5% разбавляют один к 400. При ТЭ три микролитра разбавленных эритроцитов будут использоваться на каждые 5-10 микролитров реакции, так как в анализы HRM всегда должны включаться положительные и отрицательные контрольные показатели вариабельности.

Приготовьте от 10 пикограмм до 10 нанограммов на один микролитр разведения плазмиды или стандарты с проверенными последовательностью генотипов snip в качестве положительных троллей. Используйте воду для ПЦР в качестве отрицательного контроля реакций амплификации без шаблона. Начните эту процедуру с подготовки 10 рабочих запасов праймеров и щупов.

Тот же протокол применим к анализам с использованием 96 луночных планшетов, 384 луночных планшетов, восьми полосок пробирок или стеклянных капилляров. Но для этой демонстрации будут использоваться только 96 луночные планшеты и стеклянные капилляры. В этой таблице приведены рекомендуемые 10-кратные концентрации рабочего состава, а также конечные концентрации для генотипирования HRM на основе блокированного зонда.

Приготовьте реакционные смеси к каждому. Ну и добавьте по одному микролитру каждого из 10 рабочих грунтовок и щупов прямого и обратного хода. Четыре-пять микролитров мастер-модели HRM смешивают один микролитр воды для матрицы и ПЦР для общего объема реакции 10 микролитров.

Проделайте то же самое для каждого стеклянного капилляра. Накройте пластины и стеклянные капилляры. Используйте оптические пломбы для усиления на основе пластин и пластиковые колпачки для капиллярных систем.

Убедитесь, что покрытие полностью покрыто, а пластины и колпачки полностью закрыты и надежно закреплены для предотвращения испарения. Во время усиления. Вращайте образцы, чтобы удалить пузырьки воздуха.

Вращайте планшеты в настольной центрифуге в течение трех минут со скоростью 1 800 раз G.Spin стеклянные капилляры в пико-фуге в течение 10-15 секунд. Поместите реакционную пластину и стеклянные капилляры в термоамплификатор по стандартному заблокированному зонду или протоколам амплификации MAAB. После амплификации ПЦР переходят к анализу плавления из интерфейса программного обеспечения системы.

Расплавьте пластину от 40 градусов Цельсия до 80 градусов Цельсия, чтобы получить пики плавления зонда и ампликона. Первым шагом анализа плавления на светоциклере 4 80 является нормализация по отрицательной производной нормализованной флуоресценции по отношению к температурному виду. Переместите полосы нормализации, чтобы окружить область расплавления зонда.

Область расплавления зонда — это нижняя температура двух областей плавления. Нормирующие стержни должны находиться у основания пиков расплава. После нормализации выберите «Вычислить группы» для автоматического распределения выборок по группам при необходимости, вручную переназначьте выборки в определенные группы.

Выберите сэмплы, которые не амплифицировались или имеют зубчатые пики плавления. Затем перейдите к новому звонку и выберите отрицательный. После выбора оставшихся неверно классифицированных образцов перейдите к новому вызову, выберите соответствующую группировку и нажмите кнопку Применить изменить Назначить генотипы для каждой группы на основе стандартов.

Убедившись, что вычисленные группы верны, выберите «Редактировать названия групп» на вкладке группировки. Введите генотипы стандартов в соответствующее цветное поле. Например, если стандартный 3D 7 имеет известный генотип C и находится в первой группе, то все образцы в первой группе имеют генотип C и генотипы отображаются рядом с образцами.

Наконец, экспортируйте результаты в виде файла TXT для дальнейшего анализа выборки населения. После окончания прогона на светоцикле 2.0 запишите названия образцов и положения в разделе Данные образца Перед началом анализа пометьте отрицательные контрольные значения и генотипы стандартов плавления. Начните анализ расплава, выбрав анализ, выбрав генотипирование в разделе «Анализ кривой плавления» и «Прессование». Хорошо.

Чтобы повысить чувствительность автоматической группировки, выберите все образцы так, чтобы отображение на графике кривых плавления. Сдвиньте полосу нормализации к верхней границе пиков плавления зонда. Убедитесь, что образцы были правильно сгруппированы, выбрав каждую группу по отдельности в разделе «Имя группы».

Экспортируйте генотипы для каждого образца, выбрав все образцы, скопировав данные и вставив их на лист. График отрицательной производной нормализованной флуоресценции по отношению к температуре, как правило, является наиболее простым способом визуализации пиков плавления и определения генотипов. Установка в окне анализа только области зонда приводит к четкой дифференциации пиков, соответствующих конкретным SNP.

Идеальное совпадение приводит к более высоким пикам плавления, обозначенным красным цветом. В то время как несоответствия SNP имеют более низкие температуры плавления, обозначенные серым цветом, когда оба аллеля присутствуют в образце. Анализ HRM на основе проб представляет оба аллеля в виде двух пиковых кривых, показанных оранжевым цветом, с пиками, которые соответствуют образцам отдельных аллелей, показанным красным и серым цветом, постепенное снижение температуры Илинга во время амплификации приводит к смещению в сторону мутантного аллеля, представленного левым боковым пиком в полигеномном или полиаллельном образце.

Это смещение амплификации мутантных аллелей приводит к чувствительности HRM для обнаружения минорных аллелей, присутствующих в количестве менее 1% в полигеномных или полиаллельных образцах. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что качество образца является ключевым фактором. Незначительные различия в буферных концентрациях могут смещать кривые HRM.

Использование элементов управления — полезный способ стандартизации результатов. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как использовать асимметричную ПЦР на основе проб и смещение амплификации мутантных аллелей для точного и чувствительного генотипирования малярийных SNP из различных типов образцов.