Генотипирование и количественная оценка в Ситу Гибридизации Окрашивание в зебрафиш
January 28th, 2020
Технологии редактирования генов позволили исследователям генерировать мутантов зебры для исследования функции генов с относительной легкостью. Здесь мы предоставляем руководство для выполнения параллельных генотипирования эмбрионов и количественной оценки сигналов гибридизации на месте у зебры. Такой объективный подход обеспечивает большую точность в фенотипивных анализах, основанных на гибридизации in situ.
Последствия мутаций для экспрессии генов часто оцениваются качественно путем гибридизации на месте и в целом оцениваются визуально, что субъективно и предвзято ожиданиями исследователя. Этот метод обеспечивает более последовательный способ сравнения экспериментов на месте путем количественной оценки интенсивности изображения и устраняет эту предвзятость. Это также может быть легко адаптировано к другим модельным системам, которые используют гибридизацию на месте в качестве читателя экспрессии генов.
Начните с визуализации эмбрионов, окрашенных на месте гибридизации или ISH. Приготовьте раствор глицерола и смешайте его для гомогенизации. Перенесите эмбрионы в раствор глицерола с трехми миллилитровой пипеткой Pasteur и оставьте их поселиться не менее чем на пять минут.
Подготовка и этикетка достаточно ПЦР труб для передачи ISH окрашенных эмбрионов после изображения, а затем использовать три миллилитров Пастер пипетки, чтобы добавить 100% глицерол на дно колодец стеклянной депрессии слайд. Перенесите один эмбрион, окрашенный ISH, на стеклянную горку и сориентировать его под стерео микроскопом, оснащенным цифровой камерой и нижней и верхней подсветкой. Используя первый эмбрион, отрегулируйте время освещения и экспозиции при желаемом увеличении.
Изображение столько эмбрионов, сколько требуется, и пометить каждое изображение с уникальным номером. После визуализации перенесите каждый эмбрион в трубку ПЦР, помеченную одним и тем же номером, и при необходимости аспирировать избыток глицерола из ПЦР-труб. Чтобы извлечь ДНК, добавьте от 40 до 75 микролитров щелочного буфера лиза, таких как HoTSHOT к каждой трубке.
Инкубировать трубки при 95 градусах по Цельсию в течение примерно 30 минут, а затем охладить их до четырех градусов по Цельсию. Добавьте равный объем буфера нейтрализации и приступайте к генотипизации для мутации интереса. Для выполнения анализа изображений выберите и откройте изображение на Фиджи и инвертировать его, нажав на Edit, а затем инвертировать, затем преобразовать тип изображения в 8-битный, нажав на вкладку Изображения, выбрав тип и выбрав 8-битный.
Выберите инструмент полигона и вручную нарисуйте область интереса или рентабельности инвестиций на изображении по всему региону, который содержит сигнал ISH для измерений. Нажмите T, чтобы открыть ROI Manager и выбрать область интереса, а затем нажмите Мера. Копирование среднего значения из окна результатов в электронную таблицу.
Чтобы измерить фоновую интенсивность, перемести рентабельность инвестиций в область эмбриона без окрашивания и нажмите Добавить в ROI Manager. Выберите фоновый регион и нажмите Измерение, а затем завестите среднее значение интенсивности в электронной таблице. Получить среднее интенсивность пикселей сигнала гибридизации NC2, вычитая средняя интенсивность фона из окрашенных области.
После определения среднего интенсивности пикселей каждого образца назначьте генотип каждому образцу. Если генотип не может быть определен, исключите образец из последующего анализа. Сортировать средние значения интенсивности выборки в соответствии с генотипом и приступить к статистическим тестам.
Полезность этой техники была продемонстрирована на ISH для dnmt3bb. 1 в эмбрионах из runx1 гетерозиготных incross. Снижение dnmt3bb.
1 выражение было обнаружено в runx1 гомозиготных мутантов в то время как гетерозиготные эмбрионы показали никаких существенных различий в dnmt3bb. 1 выражение. При попытке определить влияние мутации lmo4 на экспрессию runx1 этот анализ не показал существенных различий в выражении между диким типом и гомозиготными мутантами lmo4.
Тем не менее, небольшое снижение экспрессии runx1 было обнаружено одним эмбрионом qPCR. Примерно в 0,4% эмбрионов, исследованных runx1, ISH имел высокий фон, что привело к отрицательному числу, когда он был вычтен из сигнала. В таких случаях эмбрионы были исключены из анализа.
Четыре различных региона на эмбрионах были протестированы для оптимизации фоновых коррекций. Несмотря на относительно стабильную разницу в интенсивности окупаемости инвестиций в любой из фоновых областей, R3 всегда демонстрировала более высокую интенсивность, чем рентабельность инвестиций, и не должна использоваться для фоновой коррекции. R1 и R4 оказались наиболее подходящими областями для фоновой коррекции.
Важно найти наилучшие условия для визуализации и сохранить их неизменными на протяжении всего эксперимента. Мы также рекомендуем количественно оценить интенсивность пикселей, прежде чем назначать генотип каждому образцу.
Обзор
В этой статье представлен метод для параллельной генотипизации эмбрионов и количественного анализа сигналов in situ гибридизации у данио рерио. Используя этот непредвзятый подход, исследователи могут достичь большей точности в фенотипических анализах.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Генетика
- Эмбриология
Бакграунд
- Технологии редактирования генов облегчают получение мутантов данио рерио.
- In situ гибридизация является распространенным методом оценки экспрессии генов.
- Традиционные методы оценки могут вводить предубеждения и субъективность.
- Целью этого исследования является предоставление более устойчивого и количественного подхода.
Цель исследования
- Улучшить точность фенотипических анализов у данио рерио.
- Предоставить стандартизированный метод генотипизации эмбрионов.
- Количественно оценить сигналы in situ гибридизации объективно.
Используемые методы
- Визуализация гистаминированных эмбрионов с помощью стереомикроскопа.
- Приготовление глицериновых растворов для переноса эмбрионов.
- Использование щелочного лизисного буфера для экстракции ДНК.
- Применение программного обеспечения Fiji для анализа и количественной оценки изображений.
Основные результаты
- Демонстрируется снижение экспрессии dnmt3bb.1 у гомозиготных мутантов runx1.
- Определяются соответствующие зоны фоновой корректировки для анализа изображений.
- Показано, что нет значительных различий в экспрессии между диким типом и гомозиготными мутантами lmo4.
- Предоставлен надежный метод для присвоения генотипов на основе интенсивности пикселей.
Выводы
- Метод повышает надежность анализа экспрессии генов.
- Он может быть адаптирован для использования в других модельных системах.
- Сохранение устойчивых условий визуализации важно для получения точных результатов.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Quantitative in situ hybridization analysis reduces subjectivity in gene expression assessment, improving data reliability for target validation in zebrafish models. This approach supports mechanistic de-risking by enabling unbiased correlation of genotype with phenotypic expression patterns. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing standardized, replicable measurements across mixed-genotype samples.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through unbiased quantification of spatially restricted gene expression signals.
- Operational Value: Provides a consistent workflow for comparing mutant and wild-type phenotypes without observer bias.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing significant expression changes from background noise in genetic models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline expression profiles.
- Reproducibility: Standardizes image acquisition and analysis protocols to minimize inter-experiment variability.
- Quantitative Output: Generates measurable pixel intensity data suitable for statistical comparison across treatment groups.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains consistency from discovery through preclinical validation by using objective phenotypic readouts.
- Biomarker Alignment: Facilitates correlation of gene expression changes with genotypic status for translational biomarker development.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables data-driven advancement decisions by reducing false positives in target validation studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by linking genotypic confirmation with quantitative phenotypic assessment, supporting lead identification through mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by providing quantitative mRNA distribution data to clarify gene function in developmental pathways.
- Screening: Enables assay standardization through reproducible imaging and analysis conditions for reliable compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative intensity measurements and background-subtracted values that enable statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by ensuring consistent phenotypic scoring across model systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable genotyping and quantification platform applicable to multiple genes and mutant lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in gene expression data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized embryo handling and image analysis protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing objective data for capital allocation in early-stage programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by distinguishing true biological effects from technical variability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryo handling, microscopy, and basic genotyping techniques.
- Dependent on stereo microscopy with digital imaging capabilities and Fiji software for analysis.
- Necessitates cross-team standardization of imaging conditions, exposure times, and background correction regions.
- Involves adaptation considerations for different zebrafish strains and developmental stages.
- Includes practical limitations such as background correction optimization and exclusion of samples with indeterminate genotypes or high background noise.
