Генотипирование и количественная оценка в Ситу Гибридизации Окрашивание в зебрафиш

Последствия мутаций для экспрессии генов часто оцениваются качественно путем гибридизации на месте и в целом оцениваются визуально, что субъективно и предвзято ожиданиями исследователя. Этот метод обеспечивает более последовательный способ сравнения экспериментов на месте путем количественной оценки интенсивности изображения и устраняет эту предвзятость. Это также может быть легко адаптировано к другим модельным системам, которые используют гибридизацию на месте в качестве читателя экспрессии генов.

Начните с визуализации эмбрионов, окрашенных на месте гибридизации или ISH. Приготовьте раствор глицерола и смешайте его для гомогенизации. Перенесите эмбрионы в раствор глицерола с трехми миллилитровой пипеткой Pasteur и оставьте их поселиться не менее чем на пять минут.

Подготовка и этикетка достаточно ПЦР труб для передачи ISH окрашенных эмбрионов после изображения, а затем использовать три миллилитров Пастер пипетки, чтобы добавить 100% глицерол на дно колодец стеклянной депрессии слайд. Перенесите один эмбрион, окрашенный ISH, на стеклянную горку и сориентировать его под стерео микроскопом, оснащенным цифровой камерой и нижней и верхней подсветкой. Используя первый эмбрион, отрегулируйте время освещения и экспозиции при желаемом увеличении.

Изображение столько эмбрионов, сколько требуется, и пометить каждое изображение с уникальным номером. После визуализации перенесите каждый эмбрион в трубку ПЦР, помеченную одним и тем же номером, и при необходимости аспирировать избыток глицерола из ПЦР-труб. Чтобы извлечь ДНК, добавьте от 40 до 75 микролитров щелочного буфера лиза, таких как HoTSHOT к каждой трубке.

Инкубировать трубки при 95 градусах по Цельсию в течение примерно 30 минут, а затем охладить их до четырех градусов по Цельсию. Добавьте равный объем буфера нейтрализации и приступайте к генотипизации для мутации интереса. Для выполнения анализа изображений выберите и откройте изображение на Фиджи и инвертировать его, нажав на Edit, а затем инвертировать, затем преобразовать тип изображения в 8-битный, нажав на вкладку Изображения, выбрав тип и выбрав 8-битный.

Выберите инструмент полигона и вручную нарисуйте область интереса или рентабельности инвестиций на изображении по всему региону, который содержит сигнал ISH для измерений. Нажмите T, чтобы открыть ROI Manager и выбрать область интереса, а затем нажмите Мера. Копирование среднего значения из окна результатов в электронную таблицу.

Чтобы измерить фоновую интенсивность, перемести рентабельность инвестиций в область эмбриона без окрашивания и нажмите Добавить в ROI Manager. Выберите фоновый регион и нажмите Измерение, а затем завестите среднее значение интенсивности в электронной таблице. Получить среднее интенсивность пикселей сигнала гибридизации NC2, вычитая средняя интенсивность фона из окрашенных области.

После определения среднего интенсивности пикселей каждого образца назначьте генотип каждому образцу. Если генотип не может быть определен, исключите образец из последующего анализа. Сортировать средние значения интенсивности выборки в соответствии с генотипом и приступить к статистическим тестам.

Полезность этой техники была продемонстрирована на ISH для dnmt3bb. 1 в эмбрионах из runx1 гетерозиготных incross. Снижение dnmt3bb.

1 выражение было обнаружено в runx1 гомозиготных мутантов в то время как гетерозиготные эмбрионы показали никаких существенных различий в dnmt3bb. 1 выражение. При попытке определить влияние мутации lmo4 на экспрессию runx1 этот анализ не показал существенных различий в выражении между диким типом и гомозиготными мутантами lmo4.

Тем не менее, небольшое снижение экспрессии runx1 было обнаружено одним эмбрионом qPCR. Примерно в 0,4% эмбрионов, исследованных runx1, ISH имел высокий фон, что привело к отрицательному числу, когда он был вычтен из сигнала. В таких случаях эмбрионы были исключены из анализа.

Четыре различных региона на эмбрионах были протестированы для оптимизации фоновых коррекций. Несмотря на относительно стабильную разницу в интенсивности окупаемости инвестиций в любой из фоновых областей, R3 всегда демонстрировала более высокую интенсивность, чем рентабельность инвестиций, и не должна использоваться для фоновой коррекции. R1 и R4 оказались наиболее подходящими областями для фоновой коррекции.

Важно найти наилучшие условия для визуализации и сохранить их неизменными на протяжении всего эксперимента. Мы также рекомендуем количественно оценить интенсивность пикселей, прежде чем назначать генотип каждому образцу.