Генотипирование и количественная оценка в Ситу Гибридизации Окрашивание в зебрафиш
28 января 2020 г.
Технологии редактирования генов позволили исследователям генерировать мутантов зебры для исследования функции генов с относительной легкостью. Здесь мы предоставляем руководство для выполнения параллельных генотипирования эмбрионов и количественной оценки сигналов гибридизации на месте у зебры. Такой объективный подход обеспечивает большую точность в фенотипивных анализах, основанных на гибридизации in situ.
Последствия мутаций для экспрессии генов часто оцениваются качественно путем гибридизации на месте и в целом оцениваются визуально, что субъективно и предвзято ожиданиями исследователя. Этот метод обеспечивает более последовательный способ сравнения экспериментов на месте путем количественной оценки интенсивности изображения и устраняет эту предвзятость. Это также может быть легко адаптировано к другим модельным системам, которые используют гибридизацию на месте в качестве читателя экспрессии генов.
Начните с визуализации эмбрионов, окрашенных на месте гибридизации или ISH. Приготовьте раствор глицерола и смешайте его для гомогенизации. Перенесите эмбрионы в раствор глицерола с трехми миллилитровой пипеткой Pasteur и оставьте их поселиться не менее чем на пять минут.
Подготовка и этикетка достаточно ПЦР труб для передачи ISH окрашенных эмбрионов после изображения, а затем использовать три миллилитров Пастер пипетки, чтобы добавить 100% глицерол на дно колодец стеклянной депрессии слайд. Перенесите один эмбрион, окрашенный ISH, на стеклянную горку и сориентировать его под стерео микроскопом, оснащенным цифровой камерой и нижней и верхней подсветкой. Используя первый эмбрион, отрегулируйте время освещения и экспозиции при желаемом увеличении.
Изображение столько эмбрионов, сколько требуется, и пометить каждое изображение с уникальным номером. После визуализации перенесите каждый эмбрион в трубку ПЦР, помеченную одним и тем же номером, и при необходимости аспирировать избыток глицерола из ПЦР-труб. Чтобы извлечь ДНК, добавьте от 40 до 75 микролитров щелочного буфера лиза, таких как HoTSHOT к каждой трубке.
Инкубировать трубки при 95 градусах по Цельсию в течение примерно 30 минут, а затем охладить их до четырех градусов по Цельсию. Добавьте равный объем буфера нейтрализации и приступайте к генотипизации для мутации интереса. Для выполнения анализа изображений выберите и откройте изображение на Фиджи и инвертировать его, нажав на Edit, а затем инвертировать, затем преобразовать тип изображения в 8-битный, нажав на вкладку Изображения, выбрав тип и выбрав 8-битный.
Выберите инструмент полигона и вручную нарисуйте область интереса или рентабельности инвестиций на изображении по всему региону, который содержит сигнал ISH для измерений. Нажмите T, чтобы открыть ROI Manager и выбрать область интереса, а затем нажмите Мера. Копирование среднего значения из окна результатов в электронную таблицу.
Чтобы измерить фоновую интенсивность, перемести рентабельность инвестиций в область эмбриона без окрашивания и нажмите Добавить в ROI Manager. Выберите фоновый регион и нажмите Измерение, а затем завестите среднее значение интенсивности в электронной таблице. Получить среднее интенсивность пикселей сигнала гибридизации NC2, вычитая средняя интенсивность фона из окрашенных области.
После определения среднего интенсивности пикселей каждого образца назначьте генотип каждому образцу. Если генотип не может быть определен, исключите образец из последующего анализа. Сортировать средние значения интенсивности выборки в соответствии с генотипом и приступить к статистическим тестам.
Полезность этой техники была продемонстрирована на ISH для dnmt3bb. 1 в эмбрионах из runx1 гетерозиготных incross. Снижение dnmt3bb.
1 выражение было обнаружено в runx1 гомозиготных мутантов в то время как гетерозиготные эмбрионы показали никаких существенных различий в dnmt3bb. 1 выражение. При попытке определить влияние мутации lmo4 на экспрессию runx1 этот анализ не показал существенных различий в выражении между диким типом и гомозиготными мутантами lmo4.
Тем не менее, небольшое снижение экспрессии runx1 было обнаружено одним эмбрионом qPCR. Примерно в 0,4% эмбрионов, исследованных runx1, ISH имел высокий фон, что привело к отрицательному числу, когда он был вычтен из сигнала. В таких случаях эмбрионы были исключены из анализа.
Четыре различных региона на эмбрионах были протестированы для оптимизации фоновых коррекций. Несмотря на относительно стабильную разницу в интенсивности окупаемости инвестиций в любой из фоновых областей, R3 всегда демонстрировала более высокую интенсивность, чем рентабельность инвестиций, и не должна использоваться для фоновой коррекции. R1 и R4 оказались наиболее подходящими областями для фоновой коррекции.
Важно найти наилучшие условия для визуализации и сохранить их неизменными на протяжении всего эксперимента. Мы также рекомендуем количественно оценить интенсивность пикселей, прежде чем назначать генотип каждому образцу.
Обзор
В данной статье представлен метод параллельного генотипирования эмбрионов и количественного анализа сигналов гибридизации in situ у zebrafish. Использование этого объективного подхода позволяет исследователям добиться более высокой точности при проведении фенотипического анализа.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Генетика
- Биология развития
Теоретические основы
- Технологии редактирования генов облегчают создание мутантных линий zebrafish.
- Гибридизация in situ является распространенным методом оценки экспрессии генов.
- Традиционные методы оценки могут привносить предвзятость и субъективность.
- Целью данной работы является предложение более последовательного и количественного подхода.
Цель исследования
- Для повышения точности фенотипического анализа у zebrafish.
- Для обеспечения стандартизированного метода генотипирования эмбрионов.
- Для объективной количественной оценки сигналов гибридизации in situ.
Используемые методы
- Визуализация окрашенных методом ISH эмбрионов с помощью стереомикроскопа.
- Приготовление глицериновых растворов для переноса эмбрионов.
- Использование буфера для щелочного лизиса при экстракции ДНК.
- Применение программного обеспечения Fiji для анализа и количественной оценки изображений.
Основные результаты
- Продемонстрировано снижение экспрессии dnmt3bb.1 у гомозиготных мутантов runx1.
- Определены подходящие области коррекции фона для анализа изображений.
- Не выявлено значимых различий в экспрессии между диким типом и гомозиготными мутантами lmo4.
- Предложен надежный метод определения генотипов на основе интенсивности пикселей.
Выводы
- Данный метод повышает достоверность анализа экспрессии генов.
- Его можно адаптировать для использования в других модельных системах.
- Соблюдение единообразных условий визуализации имеет решающее значение для получения точных результатов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Количественный анализ гибридизации in situ снижает субъективность при оценке экспрессии генов, повышая достоверность данных для валидации мишеней в моделях zebrafish. Данный подход способствует снижению механистических рисков, обеспечивая объективную корреляцию генотипа с паттернами фенотипической экспрессии. Метод повышает прогностическую уверенность на ранних этапах поиска за счет обеспечения стандартизированных и воспроизводимых измерений в образцах со смешанным генотипом.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем объективной количественной оценки сигналов экспрессии генов с пространственным ограничением.
- Практическая ценность: обеспечивает согласованный рабочий процесс для сравнения фенотипов мутантного и дикого типов без систематической ошибки наблюдателя.
- Прогностическая ценность: способствует отбору наиболее перспективных вариантов в портфеле исследований за счет дифференциации значимых изменений экспрессии от фонового шума в генетических моделях.
Скрининг и разработка метода анализа
- Готовность анализа: Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга соединений путем установления базовых профилей экспрессии.
- Воспроизводимость: Стандартизация протоколов получения и анализа изображений для минимизации вариабельности между экспериментами.
- Количественные данные: Получение измеримых данных об интенсивности пикселей, пригодных для статистического сравнения между группами терапии.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: обеспечивает согласованность данных от этапа открытия до доклинической валидации за счет использования объективных фенотипических показателей.
- Сопоставление биомаркеров: облегчает корреляцию изменений экспрессии генов с генотипическим статусом для разработки трансляционных биомаркеров.
- Решения с учетом рисков: позволяет принимать обоснованные решения о дальнейшем продвижении на основе данных за счет снижения количества ложноположительных результатов в исследованиях по валидации мишеней.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего поиска путем объединения генотипического подтверждения с количественной фенотипической оценкой, что способствует идентификации перспективных соединений-лидеров за счет снижения рисков путем изучения механизмов действия.
- Открывающая биология: способствует проверке гипотез, предоставляя количественные данные о распределении мРНК для выяснения функции генов в путях развития.
- Скрининг: обеспечивает стандартизацию анализа за счет воспроизводимых условий визуализации и анализа для надежной оценки соединений.
- Аналитика: предоставляет количественные измерения интенсивности и значения с вычтенным фоном, что позволяет проводить статистическое сравнение экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: связывает результаты открытий с доклинической преемственностью, обеспечивая согласованную оценку фенотипа в различных модельных системах.
- Корпоративное повторное использование: создает многократную платформу для генотипирования и количественного анализа, применимую к множеству генов и мутантных линий.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения механистической неоднозначности данных об экспрессии генов.
- Операционная ценность: повышает воспроизводимость и масштабируемость благодаря стандартизированным протоколам работы с эмбрионами и анализа изображений.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go»), предоставляя объективные данные для распределения капитала в программах на ранних стадиях.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритезацию с учетом рисков, отделяя истинные биологические эффекты от технической вариабельности.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы с эмбрионами zebrafish, микроскопии и базовые методы генотипирования.
- Необходима стереомикроскопия с возможностью цифровой визуализации и программное обеспечение Fiji для анализа.
- Требуется стандартизация условий визуализации, времени экспозиции и областей коррекции фона между исследовательскими группами.
- Необходимо учитывать особенности адаптации для различных штаммов zebrafish и стадий развития.
- Существуют практические ограничения, такие как оптимизация коррекции фона и исключение образцов с неопределенным генотипом или высоким уровнем фонового шума.
