Производство РНК для транскриптомного анализа от мыши спинного мозга Моторные нейронные клетки органов лазерного захвата microdissection

Общая цель этой процедуры заключается в восстановлении высококачественной РНК из двигательных нейронов спинного мозга без контаминации РНК из соседних клеток. Это достигается путем предварительного извлечения, деления и встраивания шнура в криосреду для встраивания и замораживания при температуре минус 160 градусов Цельсия. Вторым шагом является криосекция шнура на предметных стеклах пера-пленки при температуре минус 20 градусов Цельсия.

Далее слайды промывают в 70% этаноле и окрашивают Azure B в 70% этанол. Заключительным этапом является лазерное улавливание микрорассечения тел идентифицированных клеток двигательных нейронов в буфер для лизиса тиоцианата гината. В конечном счете, общая РНК получают из объединенных лизатов и тестируют для выявления различий в общей или специфической транскрипции РНК в нейронах мутантных и диких животных.

Микродиссекция с лазерным захватом позволяет восстанавливать тела клеток двигательных нейронов из участков спинного мозга без загрязнения более многочисленными Скалиами и другими типами клеток. Это дает возможность получить РНК и сравнить транскрипцию между нейронами больного животного и нормального. Самым сложным аспектом при разработке этой процедуры было найти метод окрашивания, который позволил бы нам обнаруживать моторные нейроны в отделах спинного мозга, сохраняя при этом высокий уровень целостности РНК и способности к экстракции, как до, так и во время лазерного захвата.

Мы обнаружили, что окрашивание срезов в Azure B и 70% этаноле соответствует этим критериям в сочетании со сбором расчлененных клеточных тел непосредственно в буфер для лизиса тиоцианата гвинеи, демонстрируя процедуру Ван Падиа, постдока в нашей лаборатории для достижения наилучших результатов. Убедитесь, что все оборудование очищено с помощью обеззараживающего раствора для РНК, а затем без РНК 70% этанола после эвтаназии и транскардиальной перфузии Тщательно изолируйте спинной мозг. Промойте шнур в течение 10 секунд в РНК.

Свободная вода, чтобы смыть остатки крови и положить ее на предметное стекло без РНК очень аккуратно, но быстро. Далее разделите спинной мозг поперечно с помощью чистого бритвенного лезвия на девять-10 частей. Поместите детали в криоформу, заполненную OCT, и выровняйте их по вертикали с помощью чистой иглы.

Поместите форму в неглубокий лоток, содержащий два метилбутана, предварительно охладите их жидким азотом. Чтобы избежать деградации РНК, поместите лоток в ванну с жидким азотом. Для быстрой заморозки кусочки спинного мозга.

Храните встроенный блок ОКТ при температуре минус 80 градусов Цельсия в течение шести месяцев перед разделкой. Когда OCT готов к разделке, он встраивается в охлаждаемый криостат. Сделайте срезы по 20 микрон, каждый из которых содержит от девяти до 10 поперечных сечений спинного мозга.

Поместите срезы на свободную от РНК мембрану ручки. Предметные стекла размером два микрона первоначально хранятся при комнатной температуре, чтобы обеспечить сцепление секций. Ну и сразу же заморозьте срез на отрицательной температуре 20 градусов по Цельсию поверхность внутри криостата.

Держите слайды при температуре минус 80 градусов Цельсия до использования на чистой решетке. Шесть 50 миллилитровых конических пробирок заполнены РНК без 70% этанола. Глубина должна быть достаточной, чтобы охватить все секции горки при погружении горки.

Далее разместите 1%Azure B solution на той же стойке. Чтобы свести к минимуму время между сменой растворов во время стирки или окрашивания, держите три или четыре лабораторные салфетки перед стойкой, чтобы быстро слить лишний раствор. Когда все будет готово, достаньте слайды из морозильной камеры с отрицательными температурами 80 градусов Цельсия и поместите их на сухой лед, разморозьте одну горку, положив ее на ладонь в перчатке.

Удалите большую часть влаги и конденсата с предметного стекла, протерев его лабораторной салфеткой, стараясь не касаться секций. Поместите предметное стекло на свежий силикагель в чашку Петри на 30-40 секунд для полного высыхания. Когда оно высохнет, опустите предметное стекло в первую пробирку с РНК, освободите 70% этанола.

Замочите предметное стекло на 30 секунд, а затем смойте ОКТ, опуская его вверх и вниз в течение от 45 секунд до одной минуты. Далее достаньте предметное стекло из раствора и слейте лишнюю жидкость на лабораторные салфетки. Повторите этот процесс, опустив предметное стекло во вторую пробирку с 70% этанолом.

Если вокруг отделов спинного мозга остается ОКТ, повторите промывание в третьей трубке. После слива лишней жидкости погрузите предметное стекло в 1% раствор Azure B в 70% РНК, освободив этанол на 30-45 секунд. Слейте излишки Azure B с помощью лабораторной салфетки.

К этому моменту весь слайд будет синим. Погрузите предметное стекло в следующую пробирку с 70% этанолом и быстро опустите вверх и вниз, три-четыре раза, чтобы удалить излишки красителя и сделать видимым окрашивание конкретных двигательных нейронов. Если срезы выглядят очень темными, повторите этап окрашивания в свежей пробирке с 70% этанолом.

Если окрашивание кажется слишком светлым, верните предметное стекло в раствор Azure B еще на 32-е место и повторите окрашивание. Если окрашивание удовлетворительное, дайте предметному стеклу ненадолго высохнуть на воздухе и перейдите к следующему шагу. После окрашивания и высыхания DES серое вещество будет светло-голубым, а моторные нейроны, окрашенные в темно-синий цвет, будут хорошо видны.

Приступайте к вскрытию сразу после включения микроскопа. Разгрузите держатель пробирки, чтобы прикрепить крышку микрофуговой пробирки диаметром 0,6 мм. Для сбора образца налейте в колпачок 30 микролитров буфера для лизиса гина и тиоцианата и накройте поверхность, распределив раствор.

С помощью наконечника для дозатора совместите колпачок с отверстием и объективом. После износа программного обеспечения микроскопа удерживайте колпачок в закрытом положении до начала лазерного захвата. Поместите высушенное на воздухе предметное стекло вверх дном на предметное столико микроскопа так, чтобы сторона мембраны была обращена вниз, а срез был выровнен с отверстием.

Установив предметное стекло, сосредоточьтесь на секции спинного мозга с помощью объектива с пятью кратами, а затем перейдите к объективу с кратким увеличением 20 для вскрытия. Сначала отметьте фиктивную область световым пером и позвольте лазеру вырезать ее, не собирая. Это расслабляет мембрану и позволяет маркировать и вырезать несколько участков подряд.

Затем перефокусируйте и определите двигательные нейроны в области вентрального рога. Эти нейроны узнаваемы по расположению, пармальной морфологии, крупному размеру и темно-синему окрашиванию лазурью B. С помощью светового пера выберите инструмент для рисования и отметьте по краю мотонейроны, сделав полный контур. Постарайтесь сделать контур как можно ближе к двигательному нейрону, чтобы избежать загрязнения от других клеток.

Перед резкой можно отметить несколько ячеек, так как программное обеспечение запомнит позиции, когда будет готово к резке, опустит колпачок под позицию резки и нажмет кнопку «Пуск», чтобы начать рассечение двигательных нейронов лазером. Соберите все двигательные нейроны из всех отделов на одном предметном стекле в колпачок одной микропробирки. После завершения сбора извлеките микропробирку из держателя, выгрузив лоток и аккуратно вытеснив пробирку, полностью растворите моторные нейроны и буфер, дозируя раствор вверх и вниз.

Переместите раствор в корпус пробирки с помощью центрифугирования, немедленно заморозьте образец в сухом льду и храните его при температуре минус 80 градусов Цельсия после окрашивания лазурным B. Моторные нейроны выглядят как большие темные клеточные тела. Они подтверждаются антителами против CHATT, окрашиванием и легко дифференцируются от более мелких соседних клеток. В этом примере тела клеток двигательных нейронов были обведены световым пером и пронумерованы программным обеспечением.

Здесь тела клеток были вырезаны с помощью лазера и помещены в коллекторную трубку с выключенными контурами. Масштабы поражения лазером соседних регионов очевидны. Здесь представлены типичные результаты электрофоретического анализа целостности РНК образца из примерно 4000 тел клеток двигательных нейронов мыши, собранных с помощью LMD.

Обратите внимание на заметные пики рибосомной РНК. Этот процесс, начиная с окрашивания предметного стекла и заканчивая диссекцией двигательных нейронов, должен быть завершен в течение 30 минут для всех участков на одном предметном стекле, чтобы свести к минимуму деградацию РНК. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о необходимости работать как можно быстрее, как при первоначальном рассечении и встраивании спинного мозга, так и на заключительных этапах окрашивания и микродиссекции двигательных нейронов с помощью лазерного захвата.