Производство РНК для транскриптомного анализа от мыши спинного мозга Моторные нейронные клетки органов лазерного захвата microdissection

Общая цель данной процедуры заключается в выделении высококачественной РНК из мотонейронов спинного мозга без контаминации РНК из соседних клеток. Это достигается путем первоначального извлечения, разделения и заливки спинного мозга в среду для криофиксации с последующим замораживанием при температуре -160 °C. На втором этапе выполняется криосекционирование спинного мозга на предметные стекла с мембраной при температуре -20 °C.

Затем предметные стекла промывают в 70% ethanol и окрашивают Azure B в 70% ethanol. Заключительным этапом является лазерная захватывающая микродиссекция тел идентифицированных моторных нейронов в лизирующий буфер с гуанидинтиоцианатом. В итоге из объединенных лизатов выделяют общую RNA и анализируют ее, чтобы выявить различия в общей или специфической транскрипции RNA в нейронах животных мутантного и дикого типов.

Лазерная микродиссекция позволяет выделить тела мотонейронов из срезов спинного мозга без загрязнения более многочисленными глиальными и другими типами клеток. Это дает возможность выделить РНК и сравнить транскрипцию в нейронах больного и нормального животных. Наиболее сложным аспектом разработки данной процедуры был поиск метода окрашивания, который позволил бы обнаруживать мотонейроны в срезах спинного мозга, сохраняя при этом высокую степень целостности и экстрагируемости РНК как до, так и во время лазерного захвата.

Мы обнаружили, что окрашивание срезов красителем Azure B и 70% ethanol соответствует этим критериям при условии сбора препарированных тел клеток непосредственно в лизирующий буфер с гуанидинтиоцианатом, что подтверждает эффективность данной процедуры. Ван Падиа, постдок в нашей лаборатории, рекомендует для достижения наилучших результатов убедиться, что все оборудование было очищено раствором для деконтаминации РНК, а затем 70% ethanol, не содержащим РНК, после эвтаназии и транскардиальной перфузии. Осторожно изолируйте спинной мозг. Промойте спинной мозг в течение 10 секунд в растворе, не содержащем РНК.

Свободной водой смойте остатки крови, затем очень осторожно, но быстро перенесите образец на стеклянный предметное стекло, не содержащее РНК. Далее с помощью чистого лезвия бритвы разделите спинной мозг поперечными разрезами на 9–10 фрагментов. Поместите фрагменты в криоформу, заполненную OCT, и с помощью чистой иглы выровняйте их по вертикали.

Поместите форму в неглубокий лоток, содержащий два метилбутана, предварительно охлажденного жидким азотом. Чтобы избежать деградации РНК, поместите лоток в ванну с жидким азотом для быстрого замораживания фрагментов спинного мозга.

Храните блок, залитый в OCT, при температуре -80 °C до шести месяцев перед нарезкой. Перед началом нарезки поместите блок в OCT в охлаждаемый криостат. Изготовьте срезы толщиной 20 мкм, каждый из которых должен содержать от девяти до 10 поперечных срезов спинного мозга.

Поместите срезы на мембрану, свободную от РНК. Стеклянные предметные стекла толщиной 2 мкм изначально выдерживают при комнатной температуре для обеспечения адгезии срезов. Сразу после этого повторно заморозьте срез на поверхности с температурой -20 °C внутри криостата.

Храните предметные стекла при температуре -80 °C до использования на чистой штативной стойке. Подготовьте шесть конических пробирок объемом 50 мл, заполненных 70% этанолом, не содержащим РНКаз. Глубина жидкости должна быть достаточной, чтобы при погружении стекла все срезы на нем были полностью покрыты.

Затем поместите раствор Azure B 1% на ту же стойку. Чтобы сократить время при смене растворов во время промывки или окрашивания, положите перед стойкой три или четыре лабораторные салфетки для быстрого удаления излишков раствора. Когда всё будет готово, извлеките предметные стекла из морозильной камеры при -80 °C и поместите их на сухой лед; для размораживания одного стекла положите его на ладонь в перчатке.

Удалите большую часть влаги и конденсата с предметного стекла, протерев его лабораторной салфеткой, стараясь не касаться срезов. Поместите предметное стекло на свежий силикагель в чашку Петри на 30–40 секунд до полного высыхания. После высыхания погрузите предметное стекло в первую пробирку с 70% ethanol, очищенным от РНК.

Выдержите предметное стекло в растворе в течение 30 секунд, затем смойте OCT, совершая погружающие движения вверх-вниз в течение 45–60 секунд. Затем извлеките предметное стекло из раствора и удалите излишки жидкости с помощью лабораторных салфеток. Повторите эту процедуру, погрузив стекло во вторую пробирку с 70% ethanol.

Если вокруг срезов спинного мозга остался OCT, повторите промывку в третьей пробирке. После слива излишков жидкости погрузите предметное стекло в 1% раствор Azure B в 70% RNase-free этаноле на 30–45 секунд. Удалите излишки Azure B с помощью лабораторной салфетки.

На данном этапе весь предметный слайд окрасится в синий цвет. Погрузите слайд в следующую пробирку с 70% ethanol и быстро перемещайте его вверх-вниз три-четыре раза, чтобы удалить излишки красителя и сделать видимым специфическое окрашивание мотонейронов. Если срезы выглядят слишком темными, повторите этап дифференцировки окрашивания в новой пробирке с 70% ethanol.

Если окрашивание кажется слишком слабым, верните препарат в раствор Azure B еще на 30 секунд и повторите процедуру дестайнинга. Если интенсивность окрашивания удовлетворительная, дайте препарату ненадолго высохнуть на воздухе и переходите к следующему шагу. После проведения дестайнинга и высушивания серое вещество будет иметь светло-голубой цвет, а окрашенные в темно-синий цвет мотонейроны будут отчетливо видны.

Приступайте к диссекции сразу после включения микроскопа. Извлеките держатель пробирки, чтобы закрепить крышку микроцентрифужной пробирки объемом 0,6 мм. Для сбора образцов внесите в крышку 30 µL лизирующего буфера с гуанидином и тиоцианатом и равномерно распределите раствор по поверхности.

С помощью наконечника пипетки совместите крышку с отверстием и объективом. С помощью программного обеспечения микроскопа удерживайте крышку в закрытом положении до начала лазерного захвата. Поместите высушенный на воздухе предметное стекло на предметный столик микроскопа перевернутым образом так, чтобы сторона с мембраной была направлена вниз, а срез был совмещен с отверстием.

Установив предметное стекло, сфокусируйтесь на срезе спинного мозга с помощью объектива 5x, затем переключитесь на объектив 20x для проведения диссекции. Сначала с помощью светового пера отметьте контрольную область и позвольте лазеру вырезать ее без сбора. Это ослабит натяжение мембраны и позволит последовательно отмечать и вырезать несколько областей.

Затем заново сфокусируйтесь и идентифицируйте мотонейроны в области переднего рога. Эти нейроны узнаваемы по их расположению, морфологии, крупному размеру и темно-синему окрашиванию Azure B. С помощью светового пера выберите инструмент рисования и обведите мотонейроны по краю, создавая полный контур. Постарайтесь сделать контур максимально близким к мотонейрону, чтобы избежать попадания в область выделения других клеток.

Перед началом резки можно отметить несколько ячеек, так как программное обеспечение запомнит их координаты; когда будете готовы к резке, поместите колпачок под позицию резания и нажмите кнопку пуска для инициации диссекции мотонейронов с помощью лазера. Соберите все мотонейроны из всех срезов с одного предметного стекла в колпачок одной микроцентрифужной пробирки. После завершения сбора извлеките микроцентрифужную пробирку из держателя, выгрузив лоток и аккуратно вытолкнув пробирку; полностью растворите мотонейроны в буфере, несколько раз прокачав раствор через пипетку.

Сместите раствор на дно пробирки путем центрифугирования, немедленно заморозьте образец в сухом льду и храните его при температуре -80 °C после окрашивания Azure B. Мотонейроны выглядят как крупные темные окрашенные тела клеток. Их наличие подтверждается окрашиванием антителами к ChAT, и они легко дифференцируются от более мелких соседних клеток. В данном примере тела мотонейронов были обведены световым пером и пронумерованы программным обеспечением.

Здесь тела клеток были вырезаны лазером и помещены в пробирку для сбора при выключенном режиме отображения контуров. Очевиден масштаб повреждений соседних областей, вызванных воздействием лазера. Здесь представлены типичные результаты электрофоретического анализа целостности РНК образца, содержащего примерно 4 000 тел мотонейронов мыши, собранных методом LMD.

Обратите внимание на выраженные пики рибосомной РНК. Этот процесс — от окрашивания срезов до микродиссекции мотонейронов — должен быть завершен в течение 30 минут для всех срезов на одном предметном стекле, чтобы минимизировать деградацию РНК. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости работать максимально быстро как на начальном этапе диссекции и заливки спинного мозга, так и на заключительных этапах окрашивания и лазерной микродиссекции мотонейронов.