Анализируя сотовой Интернализация наночастиц и бактерий нескольких спектральных изображений проточной цитометрии

Проанализировать клеточные механизмы интернализации наночастиц и бактерий с помощью многоспектральной визуализационной проточной цитометрии. Макрофаги сначала обрабатывают цитоклайном D для ингибирования полимеризации актина. Наночастицы или сальмонеллы добавляют в макрофаг, монослой и инкубируют.

Затем макрофаги собираются, фиксируются и помечаются для анализа с помощью потока изображений. Клетки проточного цитометра с мультиспектральной визуализацией, которые имеют интернализованные наночастицы и/или сальмонеллу, отличаются от клеток с поверхностно связанными наночастицами и/или сальмонеллой. Полученные данные свидетельствуют о том, что как сальмонелла, так и наночастицы интернализуются только клетками, которые не подвергались обработке цитоклейном.

D, предполагая, что интернализация зависит от актина. Этот метод имеет ряд преимуществ перед существующими методами, такими как проточная цитометрия и конфокальная микроскопия. В первую очередь, он обеспечивает точное измерение интенсивности флуоресцентного сигнала и пространственного разрешения между различными функциями сотовой связи на высокой скорости.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы как для исследований биоматериалов, вакцин и лекарств, так и для исследований взаимодействия патогенов. Это включает в себя определение путей интернализации, используемых полиангидридными наночастицами и бактериями. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, часто испытывают трудности.

Важно потратить время на титрование красителей, чтобы получить оптимальные сигналы флуоресценции. Кроме того, знакомство с программным обеспечением и создание шаблонов анализа требует времени. Идея этого метода пришла нам в голову, когда мы обнаружили, что полигидронаночастицы проявляют характеристики, имитирующие патогены, при использовании микроскопии и других методов.

Затем нам потребовалась высокопроизводительная система для сравнения процессов интернализации, используемых сальмонеллой и наночастицами гидрида пыльцы перед проведением анализа. Все клеточные культуры млекопитающих и бактерий должны быть собраны, а также приготовлены суспензии наночастиц. Начните с сбора сливающихся клеток RA W2 64.7 с помощью скребка для клеток.

Определяют количество клеток с помощью гемоцитометра. Затем поместите клетки в 24-луночную чашку для культивирования с плотностью от пяти до 10 до пяти клеток на лунку в 0,5 миллилитров. Полностью инкубируйте DMEM в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и в инкубаторе с 5%-ным содержанием CO2.

Для приготовления сальмонеллы тарица разводят трансформацию сальмонеллы в C-D-M-E-M для получения кратности инфекции сотня на RA W2 64,7 клеток в автоклавной пробирке с винтовой крышкой стеклянной культуральной пробирки размером 16 на 125 мм. Затем, используя стерилизованную сывороточную бумагу, взвесьте пять миллиграммов 1% наполненных FITC полиангидридных наночастиц, полученных в соответствии с описанием коллег Реана в их публикации 2009 года и фармацевтических исследованиях, в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную пробирку. Добавьте наночастицы в 0,5 миллилитра холодного фосфатного буферного раствора и положите его на лед.

Удержание трубки на льду. Используйте ультразвуковой процессор для жидкости с микронаконечником для ультразвуковой обработки суспензии в течение примерно 25 секунд со скоростью от четырех до шести джоулей. Теперь, когда все необходимые клетки и реагенты готовы, можно проводить анализ на фагоцитоз.

Метка 24, хорошо выложить тканевые культуральные планшеты, содержащие культивируемые клетки RA W2 64,7 при подготовке к анализу на первой пластине. Каждый из следующих образцов будет проанализирован в тройном размере: cyto и D с наночастицами, cyto и D с сальмонеллой, medium с наночастицами, medium только с наночастицами сальмонеллы, только сальмонеллой, и AF с шестью 60 красильными клетками только четырех градусов Цельсия будут проанализированы на втором планшете и будут включать среду плюс наночастицы и среду плюс сальмонеллу, инкубацию при этой низкой температуре. медленные клеточные процессы, такие как фагоцитоз, за час до индукции. Добавьте пять микрограммов на миллилитр цито, а также D и C-D-M-E-M в соответствующие лунки и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия.

После инкубации сгруппируйте суспензию наночастиц и добавьте 10 микролитров в соответствующие лунки. Затем сделайте сальмонеллу вихревой и добавьте ее в соответствующие лунки при MOI 100. Постучите по тарелке несколько раз, чтобы перемешать.

Затем поместите планшеты с образцами при температуре 37 градусов Цельсия, а контрольные пластины с отрицательным результатом — при температуре четыре градуса Цельсия на 45 минут. После инкубации поместите планшеты на лед, дважды промойте клетки ледяным PBS без кальция и магния, отсасывая и отбрасывая старую среду для удаления несвязанных частиц, сальмонеллы и мертвых или отделенных клеток. Использование лепесткового магния.

Предварительная PBS на этом этапе необходима, потому что она способствует отделению клеток от субстрата Чтобы собрать клетки, добавьте 250 микролитров ледяного PBS и аккуратно соскребите лунки, пипетируйте собранные клетки в силиконизированные микроцентрифужные пробирки с защелкивающимися крышками и держите их на льду. Промойте ячейки, добавив один миллилитр холодного буфера для промывки, затем центрифугируйте при 250-кратном G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. После удаления надосадочной жидкости удалите остаточный буфер, постучав по перевернутой микроцентрифужной трубке по бумаге.

Повторно суспендируйте клеточную гранулу полотенцем, осторожно проведя микроцентрифужной пробиркой по штативу для пробирок. Чтобы закрепить клетки, добавьте 100 микролитров 4%-ного параформальдегида в PBS и дайте клеткам постоять 15 минут. При комнатной температуре промойте клетки, добавив один миллилитр буфера для химической завивки, затем центрифугируйте при 250-кратном перегрузке в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.

После удаления надосадочной жидкости удалите остаточный буфер, как и раньше. Затем окрашивать РА W2 на 64,7 клеток. Для актина добавьте 100 микролитров буфера для химической завивки, содержащего Alexa Fluora foid в шесть 60 минут.

При комнатной температуре неокрашенные образцы следует инкубировать с химической завивкой, промыть буфер без фина. После окрашивания снова промойте и центрифугируйте клетки, затем повторно суспендируйте их в 50 микролитрах PBS, содержащем 1% PFA, и храните их в темноте при четырех градусах Цельсия до приобретения. Включение, потоковая передача изображений и запуск.

Вдохните и инициализируйте fluidics в меню файлов. Выберите шаблон загрузки по умолчанию. В галерее изображений, меню просмотра, выберите все и нажмите run setup, чтобы начать отображение бусин, если это необходимо, настройте отслеживание стержня так, чтобы центрировать изображения сбоку.

Выберите канал светлого поля и нажмите «Задать интенсивность». Подождите, пока коэффициент вариации скорости потока не станет постоянно меньше 0,2%На вкладке помощи нажмите «Начать все», чтобы запустить калибровки и тесты и убедиться, что все прошло в программном обеспечении. Нажмите на кнопку загрузить образец.

Затем, получив указание сделать это, поместите флакон с самым ярким образцом. Со всеми флуорохромами в загрузчике образцов выберите 40-кратное увеличение. После того, как настройки прибора установлены, не меняйте их в течение всего эксперимента.

Включите каждый лазер в эксперименте, щелкнув по значкам лазера в программном обеспечении, и установите мощность лазера так, чтобы каждый флуорохром имел максимальные значения пикселей в пределах 104 000 отсчетов, измеренных на диаграммах рассеяния. Чтобы устранить скопление нежелательных объектов, нажмите на окно классификатора ячеек в программном обеспечении. Затем для сбора только данных ячейки выберите область нижнего предела канала один для светлого поля и установите значение 50 мкм, объекты с площадью менее 50 мкм будут считаться мусором и не будут зарегистрированы.

Выберите каналы, которые будут собираться, щелкнув соответствующие значки каналов в программном обеспечении здесь. Каналы 1, 2, 3, 4, 5 и шесть выбираются на вкладке настройки. Введите номер файла и папку назначения.

Установите порядковый номер равным единице, а количество регистрируемых событий — 5 000. Нажмите кнопку «Выполнить, получить», чтобы собрать и сохранить первый файл данных эксперимента. Нажмите кнопку FLL и запустите следующий экспериментальный образец.

Повторяйте до тех пор, пока не будут собраны все экспериментальные образцы. Далее, чтобы запустить элементы управления, нажмите на настройки композиции. Это отключит лазер яркого поля и рассеяния и позволит собирать все флуоресцентные каналы на вкладке регистрации.

Измените входное значение на 500. Затем поместите контрольную трубку и нажмите на кнопку «Выполнить». Приобретите для сбора 500 положительных клеток в одном окрашенном контроле.

Повторите для каждого флуорохрома в эксперименте, чтобы получить компенсационную матрицу. После того, как все образцы изображений будут получены, запустите программное обеспечение для анализа идей на отдельном компьютере для анализа, дважды щелкнув значок идей на рабочем столе. Дважды щелкните мастер интернализации и загрузите один из тестовых образцов файлов RIF.

Во всплывающем окне будут представлены инструкции по загрузке тестовых файлов. Следуйте инструкциям и нажмите на кнопку «Далее». Далее кликаем на новую матрицу.

Это запустит мастер компенсации. При появлении запроса выберите файлы данных для одноцветных элементов управления, чтобы добавить их. Нажмите далее через мастер, следуя инструкциям, пока файл матрицы компенсации не будет сохранен и загружен в поле на втором шаге мастера интернализации.

Нажмите далее и следуйте инструкциям, пока не будет сгенерирован файл DAF. Задайте свойства отображения изображения, выбрав каналы изображения, используемые во время съемки. Нажмите на второй канал для FITC и пятый канал для AF six 60.

Светлое поле и боковой разброс выбраны по умолчанию. Выберите канал Brightfield O one для создания границы клетки и канал O2, в котором были собраны наночастицы или бактерии для интернализующего зонда для определения популяции одной клетки, генерируется диаграмма рассеяния области светлого поля в зависимости от соотношения сторон светлого поля всех клеток. Для высокопроизводительного анализа нескольких файлов данных требуется файл шаблона, поэтому крайне важно тщательно определить ворота при создании файла шаблона.

Каждая точка представляет значения для отдельного изображения ячейки. Нажмите на сингл. на графике, чтобы выбрать изображение этой конкретной ячейки в галерее изображений.

Затем нарисуйте затвор вокруг ячеек с площадью и соотношением сторон, соответствующими событиям одной ячейки. Одиночные ячейки имеют соотношение сторон круглая единица и дублеты. Иметь соотношение сторон около 0,5.

Нажмите на несколько клеток, чтобы отличить область, содержащую одиночные клетки, от дублетов или мусора. Для построения гистограммы корня градиента светлого поля используется квадрат изображения светлого поля. Нажмите на кнопку «Далее».

Затем на вкладке «Население» выберите параметр «Ячейка», чтобы отобразить выбранную ячейку. Нажмите на ячейки, чтобы определить, где лучше всего сфокусироваться на ячейках. Начните и нарисуйте область линии для ходьбы сфокусированных клеток.

Чем выше среднеквадратичный уровень градиента, тем лучше сфокусироваться, пропустите следующий шаг, если нет других пятен, на которые можно наклеить. Построена новая диаграмма рассеяния интенсивности второго канала по оси X в зависимости от максимального количества пикселей второго канала по оси Y. Нажмите на точки и просмотрите изображения, чтобы определить область для рисования вокруг клеток, положительных на наночастицы или бактерии.

Гистограмма признака интернализации генерируется с областью, начинающейся с нуля, которую следует скорректировать путем наблюдения за изображениями. Особенностью интернализации является отношение интенсивности внутри клетки к интенсивности всей клетки. Он масштабируется таким образом, чтобы при значении нуля половина интенсивности находилась внутри.

Мастер создал область каждой ячейки, которая обозначает внутреннюю часть, сделав маску, которая используется для ввода изображения ячейки для поиска поверхности клетки и разрушил ее на четыре пикселя. Обратите внимание, что эту маску можно вручную настроить для различных типов ячеек, когда это необходимо, сначала создав маску объекта на светлопольном изображении и уменьшив его на большее или меньшее количество пикселей. Функция интернализации рассчитывается на основе этой эродированной маски объекта с помощью алгоритма в программном обеспечении.

Эта особенность позволяет нам отличать интернализованные частицы и бактерии, у которых большая часть флуоресцентного сигнала находится в пределах границы маски, от частиц, связанных поверхностью, и бактерий, которые имеют большую часть флуоресцентного сигнала за пределами границы маски, как показано в этом примере, создают новую гистограмму с новой функцией интернализации на основе маски эродированного объекта. Нарисуйте область для гейта на интернализованных ячейках, просмотрев изображение в режиме выбранной ячейки. Установите ворота в положение 0.3.Здесь.

Клетки с оценкой ниже 0,3 считаются поверхностно-связанными положительными клетками. Чтобы удалить клетки с фоновой маркировкой и идентифицировать конкретные интернализованные наночастицы или бактерии, выберите функции в меню анализа. Нажмите на меню анализа.

Затем нажмите на функцию подсчета спотов рядом с ним, чтобы добавить среднее количество спотов в отчет о статистике. В меню отчетов нажмите на иконку отчетов. Затем определите отчет по статистике, затем добавьте столбцы, затем выберите соответствующую ячейку населения.

Нажмите OK. Мастер интернализации автоматически добавит статистику в этот отчет, чтобы сохранить файл данных в качестве файла шаблона, который будет использоваться для пакетного анализа всех экспериментальных файлов. Нажмите на меню файла и выберите «Сохранить как шаблон».

Файлы шаблонов. Используйте расширение dot AST для анализа нескольких файлов данных в программном обеспечении idea. Нажмите «Инструменты», выберите файлы пакетных данных и введите все файлы RIF.

Добавьте файл матрицы компенсации и файл шаблона в соответствующие разделы, чтобы отправить партию на обработку, нажмите кнопку отправить. После этапа обработки все файлы RAF анализируются, и для каждого из отдельных необработанных файлов генерируются файлы DAF. Создается итоговый отчет со статистикой по всем образцам для сравнения влияния ингибирования актина и низкой температуры на фагоцитоз сальмонелл и наночастиц.

Клетки RA W2 64,7 инкубировали при 37 градусах Цельсия в среде, либо с цитоклайном D, либо без него, или инкубировали в среде при четырех градусах Цельсия. Как температура, так и манипуляции с актином снижали интернализацию как наночастиц, так и сальмонеллы. Тем не менее, инкубация клеток в cyto и D увеличивает процент клеток с поверхностно связанными наночастицами при одновременном снижении процента клеток с поверхностно связанными сальмонеллами.

Процент клеток, положительных на поверхностно связанные наночастицы, увеличивается с примерно 8% при 37 градусах Цельсия до более чем 35% после обработки цито и D или четырех градусов Цельсия. Напротив, процент клеток с поверхностно связанными сальмонеллами был снижен с 35% до 15%После обработки цито и D, инкубация клеток RA W2 64,7 с сальмонеллой при четырех градусах Цельсия снижала интернализацию без видимого увеличения количества поверхностно связанных бактерий по сравнению с контролем при 37 градусах Цельсия. В совокупности эти данные демонстрируют, что сальмонелла и наночастицы интернализуются в результате аналогичного клеточного процесса, который требует актина и зависит от температуры.

Более того, данные свидетельствуют о том, что устойчивое прикрепление сальмонеллы к макрофагам требует полимеризации актина. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как осуществить клеточную интернализацию наночастиц и бактерий с помощью проточной цитометрии с помощью мультиспектральной визуализации. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что ингибиторы являются цитотоксичными.

Поэтому необходимы предварительные эксперименты по профилированию цитотоксичности для определения оптимальных концентраций для использования. Не стоит забывать, что работа с сальмонеллой может быть опасной, такие меры предосторожности, как ношение соответствующих средств индивидуальной защиты и недопущение образования аэрозолей должны соблюдаться при выполнении данной процедуры.