Высокая пропускная количественном выражении Скрининг и очистка Применительно к рекомбинантный дисульфид-богатые Venom белков, продуцируемых в Е. палочка

Общая цель следующей процедуры заключается в использовании протокола скрининга экспрессии с высокой пропускной способностью для количественной оценки уровня растворимых белков в кишечной палочке с помощью автоматизированного робота для работы с жидкостями. Это достигается путем первой прививки.96. На следующий день в луночных прекультурах с клетками, трансформированными плазмидами, кодирующими целевые гибридные белки, 24 луночные планшеты, заполненные автоиндукционными средами, инокулируются ночными предкультурами для получения экспрессии.

Культуры после сбора урожая и замораживания растворимых белков из экспрессионных культур затем очищают с помощью иммобилизованной аффинной хроматографии металлов. В конечном счете, уровни растворимости для каждой интактной мишени могут быть измерены для определения оптимальных условий экспрессии для производства белка и создания успешных мишеней. Из преимуществ данной методики по сравнению с традиционными методами можно выделить повышенную эффективность, ограниченность дозы излучения от партии к партии и простоту обработки данных и слежения Визуальная демонстрация данного метода имеет решающее значение.

Автоматизированные шаги могут показаться сложными и сложными для понимания только в текстовом формате, поскольку текст не передает скорость или простоту процедуры. После трансформации бактерий начните с использования роботизированного захвата, чтобы отодвинуть крышку первой 24-луночной агаровой пластины LB. Затем используйте восьмиканальный рычаг для работы с жидкостью для смешивания, затем отасуньте 50 микролитров смеси для преобразования из 96-луночной преобразующей пластины.

Распределите трансформационную смесь в первых четырех каналах манипулятора для работы с жидкостью в первую колонну агаровой пластины LB, а трансформацию в последних четырех каналах во вторую колонну агаровой пластины LB. Тщательно промойте все наконечники после дозирования, а затем продолжайте перекладывать трансформационную смесь из 96-луночной пластины во все лунки в следующих четырех колоннах агаровой пластины LB. Эта пластина закончена. После того, как перенос на первую пластину будет завершен, установите крышку на место и начните перенос на следующую тарелку. После того, как все преобразования будут покрыты, встряхните все пластины в течение одной минуты при 1200 об/мин, чтобы получить однородное распределение смеси преобразований.

Затем, после смешивания, с помощью многоканального рычага 96 отасуньте 60 микролитров оставшейся смеси для трансформации из 96-луночной пластины и распределите смесь в глубокую лунку 96-й пластины, содержащую LB-бульон. Запечатайте глубокую лунку 96 предварительных культур дышащей клейкой пленкой, чтобы обеспечить аэрацию воздуха культуры, а затем поместите планшет в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на максимальной скорости на ночь. После того, как предварительные культуры окажутся в инкубаторе, поместите пластины с агаром LB в колпак со снятыми крышками примерно на 10 минут.

Затем переверните пластины в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия на ночь. На следующий день с помощью рычага для работы с жидкостью отсасывайте 100 микролитров предкультуры в течение ночи в глубокую лунку 96 планшета для инокуляции экспрессионных культур с помощью одного 40-го разведения, используя ту же схему, что и раньше, тщательно промывая рычаг для работы с жидкостью на станции промывки между каждой колонкой предварительных культур. Когда инокуляция будет завершена, поместите культуры для сцеживания в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия, запечатанный дышащим клеем, на четыре часа.

Затем уменьшите температуру до 17 градусов по Цельсию для ночной инкубации. На следующее утро центрифугируйте в глубокой лунке 24 планшета в течение 10 минут при давлении 3000 G. Выбросьте надосадочную жидкость в контейнер для отходов, содержащий противомикробное средство, а затем постучите пластины вверх дном по впитывающей бумаге, чтобы удалить остатки среды, чтобы убедиться, что культуры выросли правильно. Проверьте наличие пеллет в глубокой скважине.

Затем отаскайте 125 микролитров буфера для лизиса и дважды выдайте буфер в каждую лунку из глубокой лунки на 24 пластины с четырьмя наконечниками в каждую лунку. Чтобы достичь конечного объема в один миллилитр лизисного буфера для ресуспендирования гранул, встряхивайте пластины при 1200 об/мин в течение пяти минут. На роботе перенесите суспензии ячеек обратно в соответствующие лунки глубокой лунки 96 пластины и храните пластины запечатанными при температуре минус 80 градусов Цельсия в течение как минимум одного часа.

Для этой демонстрации мы будем использовать протокол с 50 микролитрами никелевых шариков для очистки целевых гибридных белков. Сначала разморозьте глубокую колодцу 96 пластин на водяной бане в течение примерно 15 минут. Затем резус суспендируют лизаты клеток в встряхивающем инкубаторе на максимальных оборотах еще на 10 минут, культуры должны стать вязкими.

Затем используйте ручную восьмиканальную пипетку для дозирования ДНК и сульфата магния Смешайте в каждой лунке глубокой луночной пластины 96 до конечной концентрации 10 микрограммов на миллилитр и 20 миллимоляров соответственно. Встряхните запечатанную пластину еще 15 минут, к этому времени культура должна стать невязкой. Чтобы избежать засорения фильтрующей пластины во время очистки, очень важно тщательно визуально проверить, что ни один из лизатов больше не является вязким.

На роботе для работы с жидкостями используйте наконечники с широким отверстием объемом 200 микролитров для тщательного перемешивания смоляной суспензии перед тем, как перекачать 200 микролитров суспензии в глубокую скважинную пластину 96, содержащую лизат. Встряхните глубокую лунку 96 при 1400 об/мин и комнатной температуре в течение 10 минут, чтобы обеспечить сцепление, а затем используйте широкие наконечники для смешивания, а затем перенесите полные 1200 микролитров суспензии лизата смолы в 200 микролитровых аликвотах на фильтрующую пластину. Теперь включите вакуум примерно на 30 секунд, чтобы отфильтровать лизат через пластину, собирая поток в глубокую лунку.

96 ниже глубокого отверстия 96, содержащего проточный поток, извлекается из-под фильтрующей пластины и хранится на решетке до окончания эксперимента. Затем дважды промойте смолу 800 микролитрами связующего буфера каждый раз после второй промывки, используйте роботизированный захват, чтобы поместить свежую, глубокую, хорошо 96 пластину под фильтрующую пластину для сбора 50 миллимоляров I мидаза. Добавьте 150 микролитров промывочного буфера на фильтрующую пластину и снова подайте вакуум до тех пор, пока буфер не пройдет через глубокую лунку 96, содержащую.

Смывка удаляется из-под фильтрующей пластины и хранится на решетке до окончания эксперимента. Затем, после еще двух промывок 800 микролитрами буфера для промывки, как показано для буфера для связывания, промывки использовали роботизированный захват для переноса микропластины на рабочий стол и надевают блок SPE и фильтровальную пластину обратно на микропластину для сбора элюциана. Затем добавьте 190 микролитров элуцианского буфера в смолу в фильтрующей пластине.

Через три минуты примените пылесос на одну минуту, чтобы пропустить весь буфер. Быстро, визуально проверьте правильность эллюцианских объемов. Наконец, блокируют образцы эллюцианской промывки и протекают через планшеты для количественной оценки уровня растворимой экспрессии.

Сначала проанализируйте эллюцианскую пластину и только при необходимости проверьте соответствующую промывку и протекание фракций. Эти данные иллюстрируют результат электрофореза с помощью лабораторной чиповой системы штангенциркуля. Интактные расщепленные слитые белки представлены верхними полосами, а расщепленные фрагменты белка представлены нижними полосами.

Было определено, что выход слияния для каждого целевого белка находится в диапазоне от 0,1 до двух, от двух до 10 и от 10 до 25 микрограммов на литр культуры, или в некоторых случаях не обнаруживается. Оценка успешности экспрессии белка по числу дисссульфидных связей, присутствующих в каждом фрагменте слитого белка, демонстрирует разумный успех для всех протестированных дисульфидных связей, при этом наименьший уровень успеха составляет 66% для мишеней, содержащих шесть дисульфидных связей. Анализ распределения успешности экспрессии на основе изоэлектрической точки и количества остатков не указывает на особую погрешность для метода, когда как успешно экспрессируемые мишени, так и мишени, которые не были обнаружены, разбросаны по всему графику.

После того, как сплавы были обнаружены и расщеплены, очищенные мишени проходят контроль качества с помощью ионизации электрораспылением, масс-спектрометрии. Здесь показана репрезентативная мишень — богатый сульфидами ядовитый белок массой 5,7 килодальтон с четырьмя дисульфидными связями. Этот спектр показывает результаты для белка до восстановления с помощью DTT, как это было после расщепления и обессоливания без дальнейшего вмешательства.

Этот спектр показывает белок после восстановления с помощью DTT с последующим обессоливанием для удаления избытка DTT. Стрелками обозначены ионы, соответствующие экспериментальным массам, а обозначение каждого иона обозначено зеленым цветом. Экспериментальные родительские массы, рассчитанные для этих ионов, приведены в таблице и соответствуют разнице масс в восемь дальтон, что эквивалентно четырем окисленным сульфидным связям.

После настройки полный протокол может быть выполнен на более чем тысяче культур в течение недели. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как использовать мелкомасштабные культуры кишечной палочки для определения успешных условий, необходимых для производства растворимого белка с использованием методов высокой производительности.