Удобный и общее выражение платформы для производства секретируемых белков из клеток человека

В пост-человеческой эры геномики, наличие рекомбинантных белков в родной конформации имеет решающее значение для структурных, функциональных и терапевтических исследований и разработок. Здесь мы описываем испытаний и масштабные экспрессии белков системы человеческих эмбриональных почек 293T клетки, которые могут быть использованы для производства различных рекомбинантных белков.

В этом видео мы описываем эффективную по времени и с минимальными затратами процедуру экспрессии секретируемых белков из произведенных Т-клеток Durant HEC 2 9 3. Первоначально получают культуру клеток с 40% Cofluent HEC 2 9 3 T в шестимерной пластине. Затем получают трансфекционную смесь путем разбавления генного сока, а затем тестируют плазмиды в среде, свободной от сыворотки.

Трансфективная смесь откладывается на клетках, которые затем инкубируются при 37 градусах Цельсия для обеспечения экспрессии белка. Определение белка в супановом агенте может быть выполнено методом вестерн-блоттинга. После того, как подходящая конструкция определена, процедура может быть масштабирована с использованием 10-слойных фабрик ячеек.

Клетки трансфицируют с использованием PEI в качестве трансфекции. Реагент и белок могут быть получены из надосадочной жидкости культуры с использованием тангенциальной проточной фильтрации с последующей аффинной хроматографией. В конечном счете, эта платформа позволяет экспрессировать широкий спектр макромолекул в миллиграммовых количествах.

Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как экспрессия клеток насекомых на основе баловируса, заключается в том, что большое количество конструкций может быть проверено и масштабировано на экспрессию, а результаты получены в течение трех недель. Демонстрировать эту процедуру будет Hello Aiden для Шады Зини и Джонатана Кука. Три аспиранта из моей лаборатории: Начните с посева 250 000 HEC 2 9 3 Т-клеток в лунку в объеме одного миллилитра в шестилуночный планшет, добавьте один миллилитр на лунку 10% FBS пентре с добавлением DMEM и S закрутите планшет для равномерного распределения клеток.

Затем инкубируйте клетки в течение ночи в увлажненном инкубаторе с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия. Как только клетки достигнут уровня владения около 40%, замените SUP natum двумя миллилитрами свежей среды для приготовления трансфекционной смеси. Сначала добавьте 90 микролитров сыворотки свободной DMEM в пробирку.

Затем добавьте три микролитра генного сока, реактив для трансфекции аккуратно перемешайте содержимое пробирки и выдержите ее при комнатной температуре в течение пяти минут. Далее добавьте 10 микролитров 100 нанограмм на микролитр запаса очищенной плазмиды мини-препарата, ДНК. Подлежит трансфекции.

Перемешайте содержимое тюбика и дайте ему настояться при комнатной температуре в течение 15 минут. Чтобы выполнить трансфекцию, нанесите смесь на HEC 2 9 3 Т-клетки. Капля за каплей осторожно набухайте пластину, чтобы равномерно распределить трансфекционную смесь.

Затем инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия. Через 24 часа добавьте по одному миллилитру свежей среды в каждую лунку и инкубируйте еще 48 часов. Через три дня после трансфекции соберите супинат и определите уровни экспрессии интересующего белка с помощью вестерн-блоттинга.

После того, как соответствующая конструкция определена, процедура трансфекции может быть расширена. Используя 10-слойные фабрики ячеек, заполните фабрику ячеек 1,2 литрами DMEM с добавлением 5% FBS. Затем добавьте 200 миллионов HEC 2 9 3 Т-клеток, равномерно распределив клетки по всем слоям.

Четыре колбы для клеточных культур T 225 сантиметров квадратного сечения, выращенные до 100% беглости Co, содержат около 200 миллионов клеток. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия на ночь. Приготовьте трансфекционную смесь в колбе с температурой Т 75, разбавив 840 мкг ДНК в 84 миллилитрах стерильного один раз. ПБС.

Добавьте 2,5 миллилитра одного миллиграмм на миллилитр, раствор полиэтилен-ионов или PEI, и выдержите смесь при комнатной температуре в течение 15 минут. Раствор должен стать мутным. Далее медленно вливаем трансфекционную смесь в клеточную фабрику и тщательно распределяем ее.

Габаритные слои. Добавьте вальпроевую кислоту в конечной концентрации четыре миллимоля. Это увеличит выход экспрессии после добавления трансфекционной смеси.

Инкубируйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия в течение четырех дней, чтобы обеспечить экспрессию белка. Соберите среду через четыре дня после трансфекции и немедленно очистите фабрику по производству клеток для повторного использования, центрифугируйте собранную среду при 6000 G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия и отфильтруйте ее через вакуумный фильтрующий аппарат с стерической чашкой 0,22 микрона для удаления любых твердых частиц. Затем с помощью системы тангенциальной фильтрации потока centra mate концентрируется надосадочная жидкость до 75 миллилитров.

После концентрации надосадочной жидкости представляющий интерес белок может быть очищен с помощью аффинной хроматографии. В этом эксперименте мы очистили отмеченные ГК субъединицы двухклеточного домена AAL двух рецепторов человека с помощью описанной здесь крупномасштабной системы, с последующей высокоаффинной анти-ТГК хроматографией. Как показано на этом анализе страницы с пятнами SDS.

Внеклеточные домены альфа и гамма-субъединиц двух рецепторов интерлейкина мигрируют с молекулярной массой 40 килодальтон и 46 килодальтон. Гетерогенность гликанов EnLink, присутствующих на IL два R альфа и IL два R гамма, вызвала расширение полосы на геле страницы SDS. Полоса с более высокой молекулярной массой представляет собой загрязняющий BSA.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как экспрессировать белки из клеточной культуры человека с использованием 10-слойных клеточных фабрик. Не забывайте, что HC 2 93 Т-клетки считаются биологически опасными и с ними следует обращаться на втором уровне биобезопасности. Пожалуйста, всегда носите надлежащую индивидуальную защитную одежду, а поверхности должны быть продезинфицированы в соответствии с институциональными и государственными рекомендациями.