Эффективный метод для количественного, анализа одноклеточные хроматина Модификация и ядерной архитектуры в целом монтажа яйцеклеток в

Общая цель данной процедуры — подготовка органов Arabidopsis для гибридизации и иммуноокрашивания целых препаратов. Это достигается путем предварительной фиксации свежих цветочных почек в фиксирующем растворе. На втором этапе проводится тщательное препарирование и помещение органов в миниатюрные акриламидные подушечки непосредственно на предметные стекла для микроскопии.

Последующая обработка ткани обеспечивает её просветление и проницаемость. Заключительным этапом является инкубация обработанных образцов с раствором антител для иммуноокрашивания или меченым зондом для флуоресцентной гибридизации in situ. В конечном итоге, конфокальная микроскопия высокого разрешения с последующей трехмерной реконструкцией позволяет проводить количественный анализ целых препаратов на уровне отдельных клеток.

Этот метод изначально использовался для изучения организации CT в области зрения, однако он также может быть применен для анализа других клеточных компартментов в других тканях или в других моделях организмов. В микроцентрифужные пробирки, заполненные свежеприготовленным буфером BBO, охлажденным на льду, поместите по 20–30 карпалий в каждую пробирку; затем осторожно перемешивайте пробирки на качалке при комнатной температуре в течение получаса. Далее центрифугируйте пробирки в течение одной минуты при 400 Gs. Затем осторожно аспирируйте супернатанты, удалите их и добавьте к карпалиям 1 мл PBT. Поместите пробирки на лед до момента монтажа каждой порции карпалий.

Охладите на льду. Подготовьте пять пробирок, содержащих по 200 µL свежеприготовленной 5% акриламидной смеси.

Пять чистых суперфростовых предметных стекол с маркировкой, нанесенной карандашом, раствор 20% PS и раствор 20% NAPS из одной пробирки с карпальными структурами. С помощью наконечника с обрезанным кончиком возьмите четыре или пять образцов и поместите их на каждое стекло. Удалите излишки жидкости, осторожно пропипетировав их с помощью тонких игл.

Сделайте продольные разрезы в запястных костях и удалите их стенки, чтобы высвободить ряды vues. Этот этап потребует определенной сноровки. Чтобы vues не пересохли, добавьте до 10 µL PBS, а затем перенесите их в микроцентрифужную пробирку с акриламидной смесью.

Быстро добавьте 12 µL NAPS и 12 µL PS.Mix. Тщательно перемешайте раствор путем пипетирования и быстро добавьте 30 µL этого активированного акриламида. Смешайте на предметном стекле с препарированными vues. Осторожно накройте препарат небольшим покровным стеклом и оставьте раствор для полимеризации при комнатной температуре примерно на один час.

Впоследствии подготовьте каждый предметный слайд таким же образом. С помощью лезвия бритвы аккуратно отколите покровные стекла. Образцы можно хранить в течение ночи при температуре 4 °C в контейнере Coplan с PBS или сразу приступить к обработке.

Как правило, обработку следует проводить в копланах с 80 миллилитрами раствора в вытяжном шкафу. Начните с обезвоживания и просветления тканей путем инкубации в серии растворов: метанол, этанол, смесь этанола и ксилола в соотношении 1:1, затем снова в этаноле и, наконец, в метаноле.

Продолжительность каждой промывки составляет 5 или 30 минут. См. текстовый протокол. Затем используйте раствор PBT с метанолом в соотношении один к одному и 2.5% formaldehyde в течение 15 минут.

Затем промойте ткань в PBT дважды по 10 минут в каждой ванне. После этого, при необходимости, предметные стекла можно хранить в течение ночи при температуре четырех градусов Цельсия. Затем извлеките из емкости до шести предметных стекол и слейте излишки жидкости.

Поместите их на бумажную салфетку и быстро добавьте 100 µL охлажденного фермента для переваривания клеточной стенки. Перемешайте прямо на салфетках. Затем накройте предметные стекла большими покровными стеклами.

Инкубируйте предметные стекла в течение двух часов при 37 °C во влажной камере. Важно оптимизировать температуру переваривания CO для каждого нового ферментативного раствора, так как этот этап имеет решающее значение для последующего гомогенного окрашивания. Промойте стекла дважды в PBT по пять минут за каждую промывку.

Затем слейте жидкость с каждого предметного стекла. Добавьте 100 µL антител к РНК А в PBS с добавлением 1% Tween и инкубируйте стекла в течение одного часа при 37 °C во влажной камере. После инкубации дважды промойте стекла раствором PBT, как было описано ранее, а затем снова зафиксируйте ткань, инкубируя стекла в свежеприготовленном растворе PBTF в течение 20 минут. Удалите PBTF, промыв стекла раствором PBT в течение 10 минут.

Затем приступают к пермеабилизации тканей, инкубируя предметные стекла в PBS с 2% tween в течение двух часов при температуре four degrees Celsius. Для удаления раствора для пермеабилизации проводят две промывки в PBT по пять минут каждая. После этого переходят к иммуноокрашиванию.

Начните с инкубации предметных стекол в растворе соответствующей первичной антителы. Нанесите на каждое стекло по 100 µL аликвоты антител, разведенных в PBS с добавлением 0,2% Tween. Перенесите стекла во влажную камеру и инкубируйте их при температуре 4 °C в течение 12–24 часов.

Промывайте предметные стекла в ванне с PBT в течение двух-четырех часов при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Затем добавьте 100 µL вторичных антител, разведенных 1:200 в PBS с 0.2% между 20 и инкубируйте стекла в течение 24 часов при 4 °C. Для удаления несвязавшихся вторичных антител достаточно одночасовой промывки в ванне с PBT при осторожном встряхивании.

Затем проведите контрастное окрашивание ДНК раствором пропидия иодида в концентрации 10 µg/mL в PBS. Оставьте образцы для окрашивания на 15 минут, после чего промойте предметные стекла раствором PBT, используя осторожное покачивание в течение 15 минут при комнатной температуре. Теперь заключите стекла в среду для предотвращения выцветания, содержащую 10 µg/mL пропидия иодида.

После того как образцы постоят в течение одного часа, сфотографируйте стекла на конфокальном микроскопе, используя глицериновый иммерсионный объектив 63x. При получении изображений крайне важно сохранять идентичные настройки сканирования для всех образцов, чтобы обеспечить возможность сравнительного количественного анализа, а также использовать линейный режим детектирования. Впоследствии реконструируйте серию изображений в трехмерные структуры, сегментируйте каждое интересующее ядро и используйте программное обеспечение для обработки 3D-изображений для количественной оценки сигналов.

Благодаря использованию этого надежного протокола масштабной подготовки, целые препараты будут сохранять свою трехмерную структуру. Субклеточные структуры становятся видны с высокой детализацией, что наглядно демонстрируется на примере хроматина. При окрашивании ДНК гетерохроматин выглядит как яркие и четко выраженные фокусы без необходимости применения деконволюции.

Данный протокол позволяет проводить параллельное иммуноокрашивание несколькими антителами за один цикл. Например, для анализа динамики хроматина в одном эксперименте на отдельных репликатных предметных стеклах были определены маркер пермиссивного эухроматина H3K4me3 и маркер гетерохроматина H3K27me1. Другим совместимым методом является флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) с 45S рРНК.

Повторы ДНК использовались для определения областей ядерной организации. Зонд был напрямую помечен Alexa 488, а ДНК была подвергнута контрастированию. Для анализа идентификации очень важно протестировать различные разведения антител и время инкубации, чтобы определить условия, обеспечивающие стабильный и однородный сигнал при минимально возможной концентрации антител.

Поскольку данный метод обеспечивает превосходную сохранность ткани и оптимальную проницаемость для анализа организации хроматина в отдельных клетках, он открывает перед учеными в области биологии растительной клетки или эпигенетики растений возможности для исследования ядерной или субклеточной организации на уровне единичной клетки и в контексте всего организма.