Эффективный метод для количественного, анализа одноклеточные хроматина Модификация и ядерной архитектуры в целом монтажа яйцеклеток в Arabidopsis

Общей целью этой процедуры является подготовка Arabidopsis Vues к гибридизации всего массива и иммуноокрашиванию. Это достигается путем предварительной фиксации свежих цветочных бутонов в фиксирующем растворе. Второй шаг заключается в тщательном препарировании и встраивании вуэ в миниатюрные акриламидные подушечки непосредственно на предметных стеклах микроскопии.

Следующая обработка тканей обеспечивает осветление и проникновение тканей. Заключительным этапом является инкубация обработанных образцов с раствором антител для иммуноокрашивания или меченым зондом для флуоресцентной гибридизации в С-2. В конечном счете, конфокальная визуализация с высоким разрешением с последующей трехмерной реконструкцией позволяет проводить количественный анализ всего монтирования на уровне одной клетки.

Этот метод первоначально использовался для того, чтобы дать представление об организации КТ в представлении, но он также может быть применен для анализа других клеточных компартментов в других тканях погружения и в других модельных организмах. В микропробирках, заполненных свежеприготовленным буфером BBO, охлажденном на льду со скоростью от 20 до 30 запястий на трубку, установить трубки в положение мягкого покачивания при комнатной температуре в течение получаса. Затем раскрутите трубки вниз в течение одной минуты при 400 G. Затем осторожно отсадите надосадочную жидкость, выбросьте их и добавьте миллилитр PBT в запястья. Поместите трубки на лед для каждой трубки запястья для крепления.

Готовимся на льду. Пять тюбиков по 200 микролитров. Свежеприготовленная смесь 5% акриламида.

Пять чистых супер морозных слайдов, помеченных карандашом, мысленная Eloqua 20% PS и мысленная Eloqua 20% NAPS из одной пробирки запястья. Возьмите четыре или пять с отрезанным кончиком и поместите их каждый на одну горку. Удалите лишнюю жидкость с помощью осторожного пипетирования с помощью тонких игл.

Сделайте продольные надрезы в запястьях и снимите стенки запястья, чтобы выпустить ряды вуэ. Этот шаг потребует практики. Предотвратите высыхание пузырьков, добавив до 10 микролитров PBS, а затем в микропробирку, содержащую смесь акриламида.

Быстро добавьте 12 микролитров NAPS и 12 микролитров PS. Хорошо перемешайте раствор с помощью пипетки и быстро добавьте 30 микролитров этого активированного акриламида. Перемешайте на предметном стекле с препарированными вуэ. Аккуратно наденьте небольшую крышку на препарат и дайте раствору полимеризоваться при комнатной температуре около часа.

Подготовьте каждый слайд таким образом позже. С помощью бритвенного лезвия откалывайте покровные чехлы. Образцы можно хранить в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия в банке Coplan с PBS или приступать непосредственно к обработке.

Как правило, обработку следует проводить в баночках коплан с 80 миллилитрами раствора. И под вытяжным шкафом. Начните с осветления тканей путем инкубации в растворе метанола этанола, растворе этанола ксилола один к одному, а затем в этаноле и затем метаноле.

Каждая ванна длится пять или 30 минут. Смотрите текстовый протокол. Затем используйте раствор метанола PBT один к одному с 2,5% формальдегидом в течение 15 минут.

Затем промойте салфетку в PBT дважды по 10 минут за ванну. После этого предметные стекла можно хранить в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия, если это необходимо. Далее возьмите до шести горок из банки и слейте лишнюю жидкость.

Положите их на папиросную бумагу и быстро добавьте 100 микролитров охлажденного фермента пищеварения клеточной стенки. Перемешайте на подушечках. Затем накройте горки большими покровными стеклами.

Выдержите предметные стекла в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия во влажной камере. Важно оптимизировать температуру расщепления CO для каждого нового ферментативного раствора, потому что этот шаг имеет решающее значение для однородного окрашивания позже. Дважды вымойте слайды с помощью PBT в течение пяти минут за одну стирку.

Затем слейте воду с горок теперь на каждую горку. Добавьте 100 микролитров РНК А в PBS, выполненный с 1%-ным твинтом, и инкубируйте предметные стекла в течение часа при температуре 37 градусов Цельсия во влажной камере после инкубации, дважды промойте предметные стекла PBT, как и раньше, а затем снова закрепите ткань, инкубировав слайды в ванне со свежеприготовленным PBTF в течение 20 минут. Смойте PBTF одной стиркой в PBT в течение 10 минут.

Затем приступайте к проникновению в ткани, инкубируя предметные стекла в PBS с 2%-ной твинцией в течение двух часов при четырех градусах Цельсия. Используйте две промывки в PBT по пять минут каждая, чтобы удалить проницаемый раствор. Затем приступают к иммуноокрашиванию.

Начните с инкубации предметных стекол в первичном антителе, представляющем интерес. Нанесите 100 микролитров аликвоты антитела, разведенного в PBS и с 0,2% между ними, на каждое предметное стекло. Перенесите предметные стекла во влажную камеру и инкубируйте их при температуре четыре градуса Цельсия в течение 12-24 часов.

Вымойте горки в ванне из ПБТ в течение двух-четырех часов с легким покачиванием при комнатной температуре. Затем добавьте 100 микролитров вторичного антитела, разведенного от одного до 200 в PBS с 0,2% от 20 до 20 и инкубируйте предметные стекла в течение 24 часов при температуре 4 градуса Цельсия. Достаточно часовой ванны в ПБТ с легким укачиванием, чтобы смыть стекла от несвязанного вторичного антитела.

Затем запятнайте ДНК раствором 10 мкг на миллилитр йодида пропидия в PBS. Оставьте окрашивание на 15 минут, а затем промойте слайды PBT, осторожно покачивая в течение 15 минут при комнатной температуре. Теперь установите предметные стекла с помощью среды, препятствующей выцветанию, с добавлением 10 микрограммов на миллилитр йодида пропидиума.

После застывания в течение часа изображение выводится на конфокальный микроскоп с использованием 63-кратной глицериновой иммерсионной линзы. Поэтому во время получения изображений крайне важно поддерживать одинаковые настройки сканирования между образцами, чтобы обеспечить сравнительную количественную оценку и использовать режим линейного обнаружения. Позже реконструируйте серийные изображения в трехмерные структуры, сегментируйте каждое интересующее ядро и используйте программное обеспечение для обработки 3D-изображений для количественной оценки сигналов.

Используя этот надежный протокол крупномасштабной подготовки, целые Mount Vue сохранят свою трехмерную структуру. Субклеточные структуры становятся видимыми с высокой детализацией, как это видно на примере хроматина. При окрашивании ДНК гетерохроматин проявляется в виде ярких и четко очерченных очагов без необходимости применения деконволюции.

Этот протокол позволяет проводить параллельное иммуноокрашивание несколькими антителами в одном раунде. Например, пермиссивный маркер, ассоциированный с U-хроматином, H три тримм, метилированный лизин 4, и гетерохроматин-ассоциированный маркер H три монометиллизина 27 были обнаружены в одном эксперименте на различных повторяющихся слайдах для анализа динамики хроматина. Другим совместимым методом является флуоресцентная гибридизация С двух или рыба до 45 с.рибосомала.

Для определения областей ядерной организации использовались повторы ДНК. Зонд был непосредственно помечен Alexa 4 88, а ДНК была окрашена счетчиками Для анализа ификации очень важно проверить различные и телесные разведения и время инкубации, чтобы определить условия, которые дают устойчивый и гогенный сигнал с минимально возможным. И телесное раскаяние.

Поскольку этот метод обеспечивает превосходную сохранность ткани и оптимальную проницаемость для анализа организации хроматина в одной клетке, он открывает путь ученым в области биологии растительных клеток или эпигенетики растений к исследованию ядерной или субклеточной организации на уровне отдельной клетки и в контексте всего человека.