Подготовка интактной ткани для микроскопического анализа клеточного слоя эндосперма в развивающихся и зрелых семенах арабидопсиса

Одним из направлений наших исследований является наука о семенах. Мы стремимся ответить на вопрос о том, как эндосперм способствует прорастанию семян. Анализ in vitro, называемый анализом ингибирования роста семян, выявил физиологическую важность эндосперма в прорастании семян. Семена арабидопсиса довольно мелкие, а клеточный слой эндосперма находится под семенниками, которые являются клетками. Подготовить образцы эндосперма без химического закрепления сложно. При предыдущем анализе анализа эндосперма использовались химически фиксированные образцы, поэтому они не смогли наблюдать за движением белков организма. Наш протокол позволяет визуализировать динамику эндоспермовых клеток с помощью пяти клеток. Наш протокол может быть выполнен с использованием стандартного лабораторного оборудования и позволяет глубже понять межклеточные события и молекулярные механизмы, а также регулярную функцию эндосперма.

[Рассказчик] Для начала выращивать растения Arabidopsis на почве или минеральной вате до стадии цветения. Отметьте полностью раскрывшиеся цветы цветными нитками, чтобы обозначить ноль дней после цветения. Отбирайте силикусы с 12 по 16 день после цветения для следующей процедуры. С помощью тонких ножниц отрежьте отмеченные развивающиеся силики на цветоножке и соберите их в пробирки объемом 1,5 миллилитров. Подготовьте влажную фильтровальную бумагу для вскрытия, чтобы предотвратить высыхание, и поместите образец под стереомикроскоп. С помощью двух щипцов, один с толстыми кончиками для удержания, а другой с острыми кончиками для разрыва. Отделите клапан от сливы. Затем с помощью щипцов с закрытыми кончиками аккуратно подхватите развивающиеся семена из силиков, чтобы не повредить их. С помощью инъекционной иглы 27 калибра создайте рубец размером примерно от 0,1 до 0,2 миллиметра на семеннике и эндосперме, окружающем эмбрион. Придерживайте семя щипцами, не раздавливая его, и сделайте рубец на стыке семядолей и прикорневых. Теперь вытолкните зародыш, зажав семя щипцами, стараясь не раздавить оболочку семени и сохраняя ее круглую форму. Вставьте инъекционную иглу в пустую оболочку с семенами у рубца и проткните его изнутри наружу. Затем удерживайте иглу на месте и используйте щипцы с закрытым концом, чтобы поцарапать поверхность семенника. Затем разрежьте одну сторону конверта с семенами, чтобы он открылся. Теперь с помощью щипцов с острым кончиком раскройте конверт с семенами в лист. Теперь выделенный образец должен представлять собой двухслойный лист, состоящий из эндосперма и теста. Поместите сухие семена арабидопсиса в пробирку объемом 1,5 миллилитра и добавьте в нее один миллилитр дважды дистиллированной воды. Держите семена впитанными не менее 40 минут при комнатной температуре. Подготовьте влажную фильтровальную бумагу на предметном столике стереомикроскопа для вскрытия и с помощью микропипетки объемом 1000 микролитров перенесите пропитанные семена на влажную фильтровальную бумагу. Теперь поместите образец под стереомикроскоп. С помощью инъекционной иглы сделайте рубец размером примерно 0,2 миллиметра на семеннике и эндосперме, окружающем эмбрион. Удерживайте семя щипцами, не раздавливая его, и нацельтесь на место соединения между семядолью и корнем для рубца. Теперь вытолкните зародыш после прищипывания семени щипцами. Избегайте раздавливания пустой оболочки с семенами и сохраняйте ее круглую форму. С помощью инъекционной иглы разрежьте верхнюю и нижнюю стороны пустого семенного конверта, чтобы придать ему цилиндрическую форму. Далее разрежьте цилиндрическую оболочку семени по центральной оси, чтобы разделить ее на две части. В результате должны получиться двухслойные листы, изготовленные из эндосперма и яичка. Поместите изолированные образцы эндосперма в виде листов на предметное стекло и опустите их в воду. Наконец, аккуратно наденьте на образец покровное стекло, убедившись, что слой эндосперма направлен вверх к покровному листу. Используйте лак для ногтей или смазку, чтобы запечатать края покровного стекла и предотвратить высыхание, прежде чем рассматривать образец под микроскопом. Многочисленные клетки эндосперма и их внутриклеточные структуры были успешно визуализированы из семян, собранных на 14 день после цветения с использованием установленного протокола подготовки. Внутри ядра клеток эндосперма были обнаружены фототельца, экспрессирующие PHYB-GFP под белым светом, подтверждающие их наличие и ядерную локализацию. Клетки эндосперма показали обратимое фотообразование тельца при чередовании дальнего воздействия красного и красного света, что подтверждает обратимость фотоPHYB и биологическую активность в течение 4,5 часов после вскрытия. Флуоресцентная покадровая визуализация митохондрий в интактных клетках эндосперма после трех часов ингибирования семян была выполнена, и было обнаружено движение митохондрий. Более динамичная митохондриальная подвижность наблюдалась в клетках эндосперма после одного дня ингибирования семян, что указывает на увеличение активности с течением времени.