Открывая белковых взаимодействий и Характеризуя Protein функций с помощью HaloTag технологии

Общая цель данной процедуры заключается в эффективном выделении белковых комплексов из клеток млекопитающих. Это достигается путем первоначальной трансфекции клеток с использованием слитого конструкта с HaloTag для экспрессии интересующего белка. На втором этапе клетки лизируют, после чего белковые комплексы ковалентно связывают с смолой с помощью HaloTag.

Затем белковые комплексы на смоле осторожно промывают для удаления любых неспецифических взаимодействий. Заключительным этапом является элюция белковых комплексов со смолы. В конечном счете, осаждение с помощью HaloTag используется для изоляции и обнаружения новых белковых взаимодействий в системах млекопитающих.

Методы, которые мы продемонстрируем вам сегодня, могут способствовать ключевым открытиям в области функциональной протеомики, включая идентификацию новых белковых взаимодействий и определение локализации белков внутри клеток. Эти процедуры сегодня проводят наши ведущие ученые, Джеки Мендес и Ален Бик. Сначала для каждого слияния или контроля подготовьте одну чашку диаметром 15 см с 30 мл клеток при концентрации от 3 до 4 × 10⁵ клеток/мл, или от 1 до 1,2 × 10⁷ клеток всего на одну конструкцию.

Инкубируйте клетки в течение 18–24 часов при 37 °C и 5% CO2. После инкубации трансфицируйте конструкт с помощью подходящего реагента для трансфекции. Через 24–48 часов после трансфекции удалите среду и аккуратно промойте слой клеток 20–25 мл ледяного PBS, затем удалите промывочный PBS и добавьте 25–30 мл охлажденного до 4 °C PBS.

После этого осторожно снимите клетки с чашки с помощью скребка для клеток. После сбора клеток в конические пробирки центрифугируйте образцы в течение пяти-10 минут при 2000 ×g и 4 °C. После удаления супернатанта поместите осадки клеток при -80 °C минимум на 30 минут или максимум на шесть месяцев.

Для каждого образца слияния или контрольного образца приготовьте 18 мл буфера для уравновешивания смолы. Осторожно перемешайте смолу, переворачивая флакон, до получения однородной суспензии. Для каждого эксперимента по осаждению (pull-down) перенесите 200 мкл смолы в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.

Центрифугируйте образец в течение одной минуты при 800 ×g. После центрифугирования осторожно удалите супернатант, не затрагивая смолу на дне пробирки. После удаления супернатанта добавьте к образцу 800 µL буфера для уравновешивания смолы и тщательно перемешайте, несколько раз перевернув пробирку. После.

Центрифугируйте образец в течение двух минут при 800 ×g. Осторожно удалите и утилизируйте супернатант. Повторите предыдущие шаги еще дважды, чтобы в общей сложности провести три промывки.

После размораживания суспендируйте осадки клеток в 300 µL предварительно приготовленного лизирующего буфера для клеток млекопитающих, многократно пропипетируя смесь. Затем перенесите содержимое в новую микроцентрифужную пробирку и добавьте 6 µL 50-кратного коктейля ингибиторов протеаз.

После этого добавьте 3 µL RQ1 DNA Binding Buffer и перемешайте образец путем инверсии в течение 10 минут. Лизируйте клетки при комнатной температуре, пропустив образец 5–10 раз через иглу шприца калибра 25G или 27G. После центрифугирования образца при 14 000 ×g в течение пяти минут при 4 °C перенесите прозрачный лизат в новую пробирку и поместите ее на лед.

Затем добавьте дополнительные 700 µL предварительно приготовленного 1X ТБС-буфера в прозрачный лизат и тщательно перемешайте, несколько раз пропипетировав раствор. Удалите последние промывочные растворы из предварительно подготовленных пробирок с уравновешенной смолой, не затрагивая слой смолы на дне каждой пробирки. Затем добавьте по 1 mL разведенного лизата в каждую пробирку.

Инкубируйте образцы при перемешивании на ротаторе для пробирок в течение 15 минут при 22 °C. После этого центрифугируйте пробирки со смолой в течение двух минут при 800 ×g. После удаления супернатанта добавьте 1 мл буфера для промывки и уравновешивания смолы и тщательно перемешайте, несколько раз перевернув каждую пробирку со смолой вручную, после чего снова центрифугируйте пробирки со смолой в течение двух минут при 800 ×g. Удалите промывочный раствор после того, как предыдущие этапы промывки будут повторены трижды.

Добавьте один миллилитр буфера для промывки и уравновешивания смолы в пробирки после инкубации образцов при 22 °C в течение пяти минут при постоянном вращении, центрифугируйте пробирки со смолой в течение двух минут при 800 ×g и удалите промывочный раствор. Затем ресуспендируйте смолу из каждого образца в 50 µL элюирующего буфера с SDS. Встряхивайте пробирки при комнатной температуре на автоматическом шейкере для микроцентрифужных пробирок в течение 30 минут.

После центрифугирования в течение двух минут при 800 ×g перенесите EIT в чистые пробирки для анализа. Для вестерн-блоттинга или окрашивания геля серебром нанесите от 5 до 10 µL образцов на SDS-денатурирующий гель для масс-спектрометрии. Храните по 40 µL каждого образца при -20 °C для последующего анализа. В восьмилуночное камерное покровное стекло для каждого слитого белка или контрольной пластины внесите по 400 µL клеток HELOC в соответствующей среде в каждую лунку с плотностью от 1 до 2 × 10⁵ клеток/мл.

После инкубации клеток в течение 18–24 часов при 37 °C и 5% CO2 проведите их трансфекцию с использованием необходимого реагента для трансфекции. Через 18–24 часа после трансфекции разведите лиганд TMR в соответствующей клеточной среде в соотношении от 1:100 до 1:200. Затем добавьте по 100 µL этого раствора в каждую лунку и осторожно перемешайте. После этого инкубируйте трансфицированные клетки с лигандом в течение 15 минут при 37 °C и 5% CO2.

По завершении аспирируйте среду, содержащую лиганд, и замените ее 500 мкл соответствующей среды без лиганда к белковому слитному тегу, предварительно нагретой до 37 °C. Повторите предыдущий этап еще дважды, чтобы в общей сложности провести три промывки. Поместите клетки обратно в инкубатор на 30 минут.

После 30-минутной инкубации аспирируйте среду и замените ее 500 microliters подходящей среды, предварительно нагретой до 37 degrees Celsius. После этого визуализируйте клетки под микроскопом с использованием соответствующих параметров получения изображений; при использовании протоколов halo, BRD four и halo tag наблюдается экспрессия контрольного белка. Экспрессию слитого белка также можно обнаружить с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител к halo tag или антител к белку-приманке.

Гели с окрашиванием серебром биологических повторностей Halo BRD four и контрольных пулдаунов демонстрируют высокую воспроизводимость и показывают белки, которые взаимодействуют с белком BRD four. Высокое содержание компонентов PTF B CDK nine и Cyclin T, а также белка BRD nine подтверждает специфический захват комплексов BRD four. На гелях были видны и другие белки, идентифицированные как потенциальные интеракторы BRD four.

В качестве дополнительного примера было проведено выделение комплексов с белком Halo HD one. В данном случае для расщепления в области линкера между Halo-тегом и H DAC one использовали ТЕV-протеазу, что позволило высвободить значительное количество белка-приманки HD one, как и наблюдалось ранее.

Образцы осаждения HDAC1 показали высокий уровень активности HDAC1, которая подавлялась ингибитором HDAC saha. Для дальнейшего подтверждения специфичности ингибирование HDAC не наблюдалось при использовании ингибитора семейства сиртуинов EX 5 27, а при использовании только буфера сигнал не обнаруживался. Клетки HEK 293, трансфицированные Halo-BRD4 и Halo-HDAC1, были флуоресцентно помечены TMR.

Визуализация лигандов показала, что оба белка локализовались в ядре, и продемонстрировала, что метка не изменила физиологическую клеточную локализацию белков, с которыми она была слита. Таким образом, после выполнения этой процедуры изолированные белки и их взаимодействующие партнеры могут быть идентифицированы и далее проанализированы с помощью различных аналитических методов, таких как масс-спектрометрия и вестерн-блоттинг.