Открывая белковых взаимодействий и Характеризуя Protein функций с помощью HaloTag технологии

Общая цель этой процедуры заключается в эффективном выделении белковых комплексов из клеток млекопитающих. Это достигается путем предварительного разрезания клеток с помощью конструкции слияния гало-меток для экспрессии интересующего белка. Второй шаг заключается в разрезании клеток и ковалентном захвате белковых комплексов на смоле с помощью гало-метки.

Далее белковые комплексы на смоле аккуратно промываются, чтобы удалить любые неспецифические взаимодействия. Заключительным этапом является вымывание белковых комплексов из смолы. В конечном счете, вытягивающие гало-метки используются для выделения и открытия новых белковых взаимодействий в системах млекопитающих.

Методы, которые мы продемонстрируем вам сегодня, могут сделать ключевые открытия в области функциональной протеомики, включая идентификацию новых белковых взаимодействий и определение локализации белков внутри клеток. Сегодня эти процедуры выполняют два наших старших ученых, Джеки Мендес и Ален Бик. Во-первых, для каждого слияния или контроля приготовьте одну 15-сантиметровую чашку с 30 миллилитрами клеток в соотношении три-четыре умножить на 10 к пятой клетке на миллилитр, или от одной до 1,2 умножить на 10 на семь клеток на конструкцию.

Инкубируйте клетки в течение 18–24 часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2. После инкубации трансфектируйте конструкцию нужным реагентом для трансфекции. Через 24-48 часов, после трансфекции, удалите среду и аккуратно промойте слой клеток 20-25 миллилитрами ледяного PBS. Удалите промойте PBS и добавьте от 25 до 30 миллилитров охлажденного PBS при четырех градусах Цельсия.

После этого аккуратно соскребите ячейки с посуды скребком для клеток. После того, как клетки были собраны в конические пробирки, центрифугируйте образцы в течение 5-10 минут при температуре 2000 G и четырех градусах Цельсия. После удаления надосадочной жидкости поместите гранулы клеток при температуре минус 80 градусов Цельсия минимум на 30 минут или максимум на шесть месяцев.

Для каждого сплавленного или контрольного образца приготовьте 18 миллилитров буфера для выравнивания смолы. Аккуратно перемешайте смолу, перевернув флакон, чтобы получить однородную суспензию. Для каждого эксперимента с понижением давления выдавайте 200 микролитров смолы в микроцентрифугу объемом 1,5 миллилитра.

Центрифугируйте образец в течение одной минуты при 800-кратном перегрузке. Осторожно удалите надосадочную жидкость, не потревожив смолу на дне трубки. После того, как надосадочная жидкость будет отброшена, добавьте в образец 800 микролитров промывочного буфера для уравновешивания смолы и тщательно перемешайте, несколько раз перевернув пробирку. После.

Центрифугирование образца в течение двух минут при 800 раз. G. Осторожно извлеките и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите предыдущие шаги еще два раза, всего три стирки.

После размораживания клеточных гранул восстановите суспензию в 300 микролитрах предварительно приготовленного лизиса млекопитающих. Буферизируйте путем пипетирования вверх и вниз. Затем переложите в новую микроцентрифужную пробирку и добавьте шесть микролитров 50 x коктейля ингибиторов протеазы.

После этого добавьте три микролитра RQ one DNA и инвертируйте образец в течение 10 минут. При комнатной температуре клетки пропускают от 5 до 10 раз через иглу шприца 25 или 27 калибра. После того, как образец был центрифугирован при температуре 14 000 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, перенесите прозрачный лизат в новую пробирку и поместите его на лед.

Далее добавьте в прозрачный лизат дополнительно 700 микролитров ранее приготовленного буфера XTBS и хорошо перемешайте пипетированием вверх и вниз. Удалите окончательные смывки из ранее подготовленных пробирок с уравновешенной смолой, не повреждая смолу на дне каждой трубки. Затем добавьте по одному миллилитру разведенного лизата в каждую трубку.

Инкубируйте образцы с перемешиванием на пробирочном ротаторе в течение 15 минут при температуре 22 градуса Цельсия. После этой центрифуги пробирки со смолой в течение двух минут при 800-кратной G. После удаления надосадочной жидкости добавьте один миллилитр промывочного буфера для уравновешивания смолы и тщательно перемешайте, перевернув каждую смоляную пробирку вручную несколько раз после центрифугирования пробирок со смолой в течение двух минут 800 раз. G. Выбросьте стирки после того, как предыдущие шаги и этапы стирки были повторены три раза.

Добавьте в пробирки один миллилитр буфера для уравновешивания смолы после инкубации образцов при температуре 22 градуса Цельсия в течение пяти минут при постоянном вращении, центрифугируйте пробирки со смолой в течение двух минут при 800-кратном перегрузке и выбросьте промывки. На этом этапе резонатор суспендирует смолу из каждого образца в 50 микролитрах элюирующего буфера SDS. Встряхните пробирки при комнатной температуре с помощью автоматического микроцентрифужного шейкера в течение 30 минут.

После центрифугирования в течение двух минут при 800-кратном G. Перенесите ЭИТ в свежие пробирки для анализа: Для вестерн-блоттинга или геля, окрашивающего серебро, загрузите от пяти до 10 микролитров образцов в денатурирующий гель SDS для масс-спектрометрии. Храните 40 микролитров каждого образца при температуре минус 20 градусов Цельсия для будущего анализа. В восьмикамерном покровном стекле для каждого гибридного белка или контрольной пластины содержится 400 микролитров клеток HELOC в соответствующих средах в каждой лунке с плотностью от одного до двух умножить на 10-пятую клетки на миллилитр.

После инкубации клеток в течение 18-24 часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 их трансфицируют желаемым реагентом для трансфекции через 18-24 часа, после трансфекции разбавляют TMR-лиганд от одного до 200 в соответствующей клеточной среде. Затем добавьте по 100 микролитров этого раствора в каждую лунку и аккуратно перемешайте. Затем инкубируйте трансфицированные клетки, содержащие лиганд, в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2.

Когда закончите, отсадите среду, содержащую лиганд, и замените ее 500 микролитрами соответствующей среды, в которой отсутствует лиганд меток слияния белков, который был предварительно предупрежден до 37 градусов Цельсия. Один раз предыдущий шаг был повторен дважды, всего три стирки. Поместите клетки обратно в инкубатор на 30 минут.

После 30-минутной инкубации отсадите среду и замените ее на 500 микролитров соответствующей среды, предварительно прогретой до 37 градусов Цельсия. После получения этого изображения наблюдаются клетки на микроскопе с использованием соответствующих параметров регистрации с использованием протокола halo, BRD four и контрольной экспрессии гало-меток. Экспрессия гибридного белка также может быть обнаружена с помощью вестерн-блоттинга с антителами против гало-меток или антителами к белку-приманке.

Серебряные окрашивающие гели биологических репликатов Halo BRD four и контрольных пулдаунов демонстрируют высокую воспроизводимость и показывают белки, которые взаимодействуют с белком BRD 4. Высокое содержание компонентов из PTF, B, CDK nine и циклина T, а также белка BRD nine подтверждает специфический захват четырех комплексов BRD. Гели показали другие белки, идентифицированные как потенциальные интеракторы BRD 4.

В качестве дополнительного примера были проведены сложные выделения с помощью белка Halo HD one. В этом случае протеаза TEV использовалась для расщепления в области линкера между Halo tag и H DAC one, высвобождая значительные количества белка-приманки HD one. Как и наблюдалось.

Образцы HD one pulldown показали высокий уровень активности HD One, который ингибитор HDA saha. Чтобы еще больше продемонстрировать специфичность, ингибирование HDA не наблюдалось при использовании ингибитора семейства сиртуинов EX 5 27, и не было обнаружено ни одного сигнала при использовании только буфера. Клетки He A, трансфицированные Halo BRD 4 и Halo HDAC One, были флуоресцентно помечены TMR.

Визуализация лигандов показала, что оба они локализованы в ядре и демонстрируют, что метка не изменяет физиологическую клеточную локализацию своих партнеров по слиянию. Таким образом, после этой процедуры изолированные белки и их взаимодействующие партнеры могут быть идентифицированы и дополнительно проанализированы с использованием различных аналитических методов, таких как масс-спектрометрия и вестерн-блоттинг.