Идентификация белка взаимодействие партнеров, используя тандем аффинной очистки

Общая цель этой процедуры заключается в использовании метода, известного как тандемная аффинная очистка, для выделения партнеров, связывающих белки. Здравствуйте, я dLAN Bailey из секции вирусологии в Имперском колледже Лондона. В нашей лаборатории мы работаем над взаимодействием вируса с хозяином для различных членов семейства вирусов.

Идентификация белков, которые взаимодействуют с другими клеточными или вирусными белками, является отличной отправной точкой для исследования взаимодействия между вирусом и его хозяином во время инфекции. В этом видео я объясню один из подходов, который мы используем в нашей лаборатории: тандемная и электронная очистка или тапирование. Метка Tap, используемая в этом исследовании, представляет собой N-концевую метку, состоящую из двух единиц белка G и пептида, связывающего стрептококк адин.

Они разделены последовательностью расщепления протеазы TEV, которая позволяет специфически элюировать белок приманки. В этом примере у мыши, EIF four E находится на С-конце этой конструкции слияния. Протокол тап-меток представляет собой шестиэтапную процедуру.

После трансфекции и генерации клеточных линий клетки индуцируются к экспрессии белка Abate метки, прежде чем они будут помещены в буфер для мягкого лизиса. Для очистки приманки и любых потенциальных взаимодействующих партнеров для создания клеточных линий используются два этапа аффинной очистки и два специальных раствора. Клетки HEC 2 93 должны быть трансфицированы с помощью векторного кодирования экспрессии P met four.

Затем отбирают помеченные краном белковые клетки с помощью гигромицина В. Поскольку плазмида поддерживается в эпизоне, нет необходимости выделять специфические клоны. 10 сливчатых чешуек клеток индуцируются обработкой 10 микромолярного хлорида кадии в течение 16 часов, прежде чем их соскабливают в среду. Затем взвешенные элементы переносят в пробирки 15 М, а клетки гранулируют центрифугированием.

Затем эти ячейки трижды промываются ледяным PBS, прежде чем окончательно гранулироваться. На втором этапе клетки лизиса клетки помещаются в пять мил холодного буфера для лизиса путем повторного пипетирования перед тем, как их оставляют на льду на пять минут. Чтобы обеспечить эффективный лизис, клетки затем проходят через тупую иглу узкого калибра и замораживают.

Полученный сат распределяют по пробиркам диаметром 1,5 мила, а клетки и мусор удаляют центрифугированием. Следует отметить, что после этой стадии центрифугирования размер гранул заметно уменьшается. Затем надосадочная жидкость лизата объединяют в 15-миловой пробирке Falcon и пропускают через фильтр 0,45 микрометра для удаления любого дополнительного мусора.

Для последующего анализа следует взять 50 микролитров аликвот этого лизата. Этот образец называется образцом один. Шаг третий, привязка к кролику IgG Aeros.

На этом этапе протокола метки белка G представляют собой иммуноципитацию, выпавшую в осадок IgG у кроликов. Чтобы выделить бусины, удалите конец кончика обезьяны. Это помогает избежать повреждения бусин.

Осторожно восстановите суспендию раствора IgG у кролика, поворачивая флакон перед тем, как извлечь его в трубку 15 мил. Промойте арос три раза в охлажденном буфере для лизиса с использованием низкоскоростного центрифугирования для осветления шариков на каждом этапе. Гранулированные гранулы IgG кролика должны быть видны после центрифугирования.

После каждого шага осторожно снимайте буфер, не тревожа бусины. После завершения окончательной промывки добавьте отфильтрованный и осветленный лизат в упакованные бусины и выдерживайте в течение трех часов или в течение ночи. Он предпочитателен при температуре четыре градуса Цельсия с помощью вращающегося миксера.

После иммунопреципитации закрутите шарики агроса и удалите надосадочную жидкость для последующего анализа. При необходимости вы можете использовать тонкий наконечник для сборки, чтобы удалить остатки жидкости из этой трубки. Этот надосадочная жидкость является образцом расщепления протеазы TEV второго этапа четвертого этапа.

На этом этапе приманка отщепляется от белковых G-меток. Этот этап позволяет эффективно осуществлять специфическое расщепление белка приманки, а этап элюирования от кроликов IgG вызывает иммунопреципитацию. Приготовьте смесь для расщепления TEV и добавьте ее в бусины с помощью кончика обезьяны с удаленным концом, переложите эту смесь в силиконизированную микроцентрифужную пробирку и переверните для смешивания арос в суспензию перед ночной инкубацией при четырех градусах Цельсия, удалите алико этой реакции расщепления TEV для анализа.

Это пример третий. Ночная инкубация на вращающемся смесителе должна позволить реакции TEV протекать почти до полного завершения. Шаг пятый, перевязывание для обездвиживания стрепстрепто-адиновых бусин.

На этом этапе приманка Cleve и любые потенциальные партнеры по связыванию очищаются от сродства от раствора. Во-первых, центрифугируйте реакцию расщепления TEV, содержащую бусины IgG кролика. Чтобы гранулировать арос, удалите ОТТ осветленной надосадочной жидкости для анализа.

Это пример четвертый. Аккуратно удалите всю оставшуюся надосадочную жидкость, которая содержит вашу прикормочную белковую жидкость, в свежую трубочку. Опять же, используйте нормально.

Соберите бодрые кончики, чтобы удалить все возможные надосадочные вещества. Сохраните у кролика бусины IgG для последующего анализа. Это пример пятый.

Чтобы предотвратить повреждение стрептококковых бусин, удалите конец с наконечника питомца. Аккуратно суспензируйте бусины и извлеките алико в силиконизированную трубку. Промойте стрептококк имеющими в шариках шариками с S буфером, осветлив методом центрифугирования на низкой скорости.

После каждой стирки. После каждой стирки аккуратно снимайте буфер. Стрептовые бусины адина очень маленькие и могут быть легко смещены даже при мелком использовании.

Соберите советы для питомцев. После стреппинга адина бусины были промыты. Добавьте к этим шарикам надосадочную жидкость из реакции расщепления TEV и инкубируйте реакцию в течение трех часов или в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия с помощью вращающегося миксера.

После инкубации центрифуга имеет стрептеп, имеют бусины и удаляют суп натум. Это пример шестой. На заметку.

Белок Бейт теперь связан с оставшимися шариками в пробирке. Промойте шарики стрептавидина, содержащие белок приманки, буфером для лизиса. Чтобы удалить любые дополнительные загрязняющие белки, удалите остатки моющего раствора с шариков и оставьте их на льду.

Шаг шестой, элюирование биотином. На этом этапе биотин добавляется в бусины стрептавидина. Взаимодействие между биотином и шариками стрептавидина вытесняет приманку, которая возвращается в раствор.

Добавьте раствор биотина прямо в бусины и переверните для перемешивания. Инкубируйте реакцию при температуре 4 градусов Цельсия в течение трех часов или в течение ночи с помощью вращающейся центрифуги смеси биотина и осторожно соберите смесь в свежую пробирку. Это ваш окончательный EIT, называемый образцом семь.

Остальные стрептовые бусины имеют восьмой пробу. Из-за низкой концентрации белка этот конечный элюат необходимо сконцентрировать перед анализом. Это достигается за счет использования низких молекулярных масс, отрезанных спиновых колонок, уменьшения объема за счет центрифугирования, регулярного контроля процесса.

Этот концентрированный образец может быть разделен и проанализирован на гелях страницы SDS с помощью кумаси и серебряного красителя. Если образцы должны быть проанализированы с помощью масс-спецификации, мы рекомендуем использовать сборные коммерческие гели. Затем можно извлечь отдельные полосы и идентифицировать белки с помощью масс-спектрометра.

В данном случае приманкой служила мышка, ЭИФ на Е белок. Преимущество системы TAP заключается в том, что у вас есть возможность экспрессировать интересующий вас белок в определенной клеточной линии, и в зависимости от интересующей вас клеточной линии, она также дает вам возможность экспрессировать белок на относительно низких уровнях. Вы решаете, и все пост-трансляционные модификации и локализация сохраняются, так что вы часто можете очистить нативный комплекс.