Идентификация белка взаимодействие партнеров, используя тандем аффинной очистки
25 февраля 2012 г.
Тандем аффинной очистки является надежным подходом для идентификации связывания с белками партнеров. В качестве доказательства концепции, эта методика была применена к хорошо характеризуется фактор инициации трансляции eIF4E к сотрудничеству осадок факторов клетки-хозяина, участвующих в инициации трансляции. Этот метод легко адаптирована к любой сотовой или вирусных белков.
Общая цель данной процедуры — использовать метод, известный как тандемная аффинная очистка, для выделения белков-партнеров по связыванию. Здравствуйте, я дЛАН Бейли из отделения вирусологии Имперского колледжа Лондона. В нашей лаборатории мы изучаем взаимодействия вирусов с хозяином для различных представителей семейства вирусов.
Идентификация белков, которые взаимодействуют с другими клеточными или вирусными белками, является отличной отправной точкой для изучения взаимосвязи между вирусом и его хозяином во время инфекции. В этом видео я объясню один подход, который мы используем в нашей лаборатории: тандемную аффинную очистку или TAP-тэгирование. Tap-тэг, используемый в данном исследовании, представляет собой N-терминальный тэг, состоящий из двух единиц белка G и стрептавидин-связывающего пептида.
Они разделены последовательностью расщепления TEV-протеазой, которая позволяет осуществлять специфическую элюцию белка-приманки. В данном примере мышиный EIF4E находится на C-конце этого химерного конструкта. Протокол TAP-тэгирования представляет собой процедуру из шести этапов.
После трансфекции и создания клеточных линий клетки индуцируют для экспрессии белка с меткой abate, после чего проводят лизис в мягком лизирующем буфере. Для очистки приманки и любых потенциальных взаимодействующих партнеров при создании клеточных линий используются два этапа аффинной очистки и два специфических раствора. Клетки HEK 293 следует трансфецировать экспрессионным вектором pMET4, кодирующим данную последовательность.
Затем клетки с белком-приманкой, имеющим TAP-тег, отбирают с помощью гигромицина B в концентрации 100 мкг/мл. Поскольку плазмида поддерживается эписомально, необходимости в изоляции отдельных клонов нет. В 10 колбах с конфлюэнтными клетками индуцируют экспрессию путем обработки 10 мкМ хлорида кадмия в течение 16 часов, после чего клетки снимают со дна в среду. Взвесь клеток переносят в 15 мл пробирки и осаждают центрифугированием.
Затем эти клетки трижды промывают ледяным PBS, после чего окончательно осаждают центрифугированием. На втором этапе лизиса клетки подвергают лизису в 5 мл холодного лизирующего буфера путем повторного пипетирования, после чего выдерживают на льду в течение пяти минут. Для обеспечения эффективного лизиса клетки затем пропускают через иглу с узким просветом и тупым концом с помощью шприца, после чего подвергают циклам замораживания-оттаивания.
Полученный лизат распределяют по пробиркам объемом 1,5 мл, после чего нелизированные клетки и клеточный детрит удаляют путем центрифугирования. Стоит отметить, что после этого этапа центрифугирования размер осадка заметно уменьшается. Супернатанты лизатов затем объединяют в пробирке Falcon объемом 15 мл и пропускают через фильтр с порами 0,45 мкм для удаления любых дополнительных остатков детрита.
Для последующего анализа следует отобрать аликвоты этого лизата объемом 50 µL. Данный образец обозначается как образец один. Шаг три: связывание с кроличьими IgG Aeros.
На данном этапе протокола теги белка G иммунопреципитируют с помощью rabbit IgG aros. Чтобы распределить гранулы aros, срежьте кончик наконечника дозатора. Это поможет избежать повреждения гранул.
Осторожно ресуспендируйте раствор кроличьего IgG-арос, вращая флакон круговыми движениями, после чего перенесите арос в пробирку объемом 15 мл. Трижды промойте арос в охлажденном лизирующем буфере, используя центрифугирование на низких скоростях для осаждения гранул на каждом этапе. После центрифугирования должен быть виден осадок гранул кроличьего IgG.
После каждого этапа осторожно удаляйте буфер, стараясь не потревожить гранулы. После завершения последней промывки добавьте отфильтрованный и осветленный лизат к упакованным гранулам и инкубируйте в течение трех часов или в течение ночи. Рекомендуется проводить инкубацию при 4 °C с использованием ротационного миксера.
После иммунопреципитации центрифугируйте агарозные бусины и удалите супернатант для последующего анализа. При необходимости можно использовать наконечник с узким отверстием, чтобы удалить остатки жидкости из пробирки. Этот супернатант представляет собой образец два шаг четыре для расщепления ТЕV-протеазой.
На данном этапе приманка отделяется от тегов белка G. Этот этап обеспечивает специфическое расщепление белка-приманки, что фактически является этапом элюции из иммунопреципитации IgG кролика. Приготовьте смесь для расщепления TEV-протеазой и добавьте ее к бусинам, используя наконечник с обрезанным концом; перенесите эту смесь в силиконизированную микроцентрифужную пробирку и переверните ее для перевода бусин в суспензию перед инкубацией в течение ночи при температуре 4 °C. Отберите аликвот этой реакции расщепления TEV для анализа.
Это образец номер три. Инкубация в течение ночи на ротационном миксере должна позволить реакции с TEV протеазой дойти почти до завершения. Шаг пять, связывание с иммобилизованными стрептавидин-гранулами.
На этом этапе проводится аффинная очистка приманки Cleve и любых потенциальных партнеров по связыванию из раствора. Сначала центрифугируйте смесь после реакции расщепления TEV, содержащую шарики aros с IgG кролика. Чтобы осадить шарики aros, удалите часть осветленного супернатанта для последующего анализа.
Это образец четыре. Осторожно перенесите весь оставшийся супернатант, содержащий ваш белок-приманку, в новую пробирку. Снова используйте тонкий.
Сконструируйте наконечники для пипеток таким образом, чтобы удалить весь возможный супернатант. Сохраните бусины aros с IgG кролика для последующего анализа. Это образец номер пять.
Чтобы избежать повреждения бусин strep adin, удалите кончик с наконечника pet. Осторожно ресуспендируйте бусины и перенесите аликвот в силиконизированную пробирку. Промойте бусины strep с помощью буфера S, очищая их путем низкоскоростного центрифугирования.
После каждой промывки. После каждой промывки осторожно удалите буфер. Сорбирующие частицы с стрептавидином очень малы и могут быть легко смещены даже при использовании тонкого наконечника.
Подготовьте бусы Strept Adin. После промывки бус Strept Adin добавьте к ним супернатант из реакции расщепления TEV и инкубируйте смесь в течение трех часов или в течение ночи при 4 °C, используя ротационный миксер.
После инкубации центрифугируйте смесь с магнитными частицами, покрытыми стрептоавидином, и удалите супернатант. Это образец шесть. Примечание.
Белок-приманка теперь связан с оставшимися в пробирке гранулами. Промойте гранулы стрептавидина, содержащие ваш белок-приманку, буфером для лизиса. Чтобы удалить любые дополнительные contaminating белки, удалите остатки промывочного раствора из гранул и поместите их на лед.
Шаг шесть, элюция биотином. На этом этапе к hạt-бусинам со стрептавидином добавляют биотин. Взаимодействие между биотином и стрептавидином вытесняет приманку, которая возвращается в раствор.
Добавьте раствор биотина непосредственно к гранулам и перемешайте путем инверсии. Инкубируйте реакционную смесь при 4 °C в течение трех часов или в течение ночи, используя ротационный смеситель-центрифугу, затем осторожно перенесите смесь в новую пробирку. Это ваш конечный EIT, обозначенный как образец семь.
Оставшиеся бусины со стрептавиадином представляют собой образец восемь. Из-за низкой концентрации белка этот финальный элюат необходимо сконцентрировать перед анализом. Это достигается с помощью центрифужных колонок с низким пределом отсечения по молекулярной массе; объем уменьшают путем центрифугирования, регулярно контролируя процесс.
Этот концентрированный образец можно разделить и проанализировать с помощью SDS-ПААГ, используя окрашивание кумази или серебром. Если образцы предназначены для анализа методом масс-спектрометрии, мы рекомендуем использовать готовые коммерческие гели. После этого отдельные полосы можно вырезать, а белки идентифицировать с помощью масс-спектрометрии.
В данном случае в качестве приманки использовался мышиный EIF для белка E. Преимущество системы TAP заключается в возможности экспрессировать интересующий вас белок в определенной клеточной линии, а в зависимости от выбранной линии — экспрессировать белок на относительно низком уровне, если вы этого пожелаете; при этом сохраняются все посттрансляционные модификации и локализация, что часто позволяет очистить нативный комплекс.
Обзор
Тандемная аффинная очистка представляет собой мощный метод идентификации белков-партнеров по связыванию. Данный метод был применен к фактору инициации трансляции eIF4E для ко-преципитации факторов клетки-хозяина, участвующих в инициации трансляции.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Вирусология
- Исследование взаимодействия белков
- Клеточная биология
Теоретические основы
- Тандемная аффинная очистка (TAP) — это метод, используемый для выделения белковых комплексов.
- TAP-метка состоит из белка G и стрептавидин-связывающего пептида.
- Данный метод позволяет осуществлять специфическую элюцию белков-приманок.
- Понимание белковых взаимодействий имеет решающее значение для изучения динамики взаимодействия вируса и хозяина.
Цель исследования
- Изолировать и идентифицировать белки, взаимодействующие с фактором инициации трансляции eIF4E.
- Исследовать взаимодействие между вирусными и клеточными белками хозяина во время инфекции.
- Продемонстрировать применимость метода TAP для различных белков.
Используемые методы
- Трансфекция клеток HEC 293 экспрессионным вектором с TAP-меткой.
- Лизис клеток и очистка с использованием кроличьего IgG и стрептавидиновых бусин.
- Расщепление TEV-протеазой для специфического элютирования белков-приманок.
- Многократные этапы промывки и центрифугирования для обеспечения чистоты образцов.
Основные результаты
- Успешное выделение eIF4E и его взаимодействующих партнеров.
- Демонстрация эффективности метода TAP в идентификации белковых комплексов.
- Идентификация потенциальных факторов хозяина, участвующих в инициации трансляции.
- Подтверждение возможности адаптации данного метода для других белков.
Выводы
- Тандемная аффинная очистка является эффективным подходом для изучения белковых взаимодействий.
- Этот метод может быть применен к различным клеточным и вирусным белкам.
- Понимание этих взаимодействий позволяет получить представление о патогенезе вирусов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Идентификация белок-белковых взаимодействий является основополагающим этапом валидации мишеней и снижения механистических рисков в программах биофармацевтических разработок. Тандемная аффинная очистка (TAP) позволяет изолировать нативные белковые комплексы в условиях, близких к физиологическим, что обеспечивает достоверность подтверждения взаимодействия с мишенью и картирования сигнальных путей. Данный подход снижает количество ложноположительных результатов при первичном скрининге и повышает прогностическую точность кампаний по идентификации ведущих соединений.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем выделения прямых и косвенных партнеров по связыванию с белками-приманками, такими как eIF4E.
- Практическая ценность: способствует функциональной валидации мишеней посредством идентификации известных компонентов комплекса, таких как eIF4G, 4EBP-1, eIF4A и поли-А-связывающий белок.
- Прогностическая ценность: улучшает отбор кандидатов в портфель за счет дифференциации специфических интеракторов от фонового сигнала с использованием контролей с одним только TAP-тегом.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующих этапов анализа путем захвата эндогенных комплексов с сохраненными посттрансляционными модификациями.
- Практическая ценность: Обеспечение стандартизации и воспроизводимости анализа за счет определенных этапов элюции (с помощью TEV-протеазы и биотина) и строгих протоколов промывки.
- Масштабируемость: Возможность повторного использования платформы для различных клеточных линий посредством экспрессии эписомальных плазмид, что позволяет избежать создания клональных линий.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Обеспечивает актуальность для изучения заболеваний путем исследования eIF4E в капе-зависимой инициации трансляции — пути, который нарушен при раке и вирусных инфекциях.
- Доклиническое соответствие: Связывает результаты фундаментальных исследований с механистическим снижением рисков путем идентификации вторичных интеракторов, определяющих контекст сигнального пути.
- Прогресс с учетом рисков: Обосновывает решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), уточняя механизм действия мишени и целостность комплекса перед оптимизацией ведущего соединения.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Метод TAP вписывается в континуум исследований — от анализов взаимодействия с мишенью до доклинической валидации, особенно для тех мишеней, где целостность нативного комплекса критически важна для выполнения функции.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей путем выделения комплексов, ассоциированных с eIF4E, в условиях индуцибельной экспрессии.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет количественных результатов, получаемых путем идентификации полос методом масс-спектрометрии после разделения с помощью SDS-PAGE.
- Аналитика: позволяет проводить сравнительный анализ условий благодаря специфическим этапам элюции, которые снижают уровень неспецифического связывания.
- Трансляционные исследования: способствует поиску биомаркеров путем идентификации факторов инициации трансляции, имеющих значение для онкогенного сигналинга.
- Корпоративное повторное использование: может быть использована как универсальный метод для множества белков-приманок благодаря модульной конструкции TAP-метки и эписомальной системе экспрессии.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышение достоверности прогнозов при валидации мишеней, снижение механистической неопределенности и сохранение нативных комплексов.
- Операционная ценность: стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость для различных клеточных линий и белков-приманок.
- Стратегическая ценность: более обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), эффективность использования капитала и снижение биологических рисков на поздних этапах за счет ранней характеристики комплексов.
- Влияние на портфель: приоритезация и принятие решений о продвижении проектов с учетом рисков на основе валидированных данных интерактома.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области молекулярного клонирования, транзиторной трансфекции и методов аффинной очистки.
- Зависит от наличия центрифугирования, ротационных смесителей, ингибиторов протеаз и инфраструктуры для масс-спектрометрии.
- Необходима межгрупповая стандартизация дизайна тегов, протоколов индукции и строгости промывки.
- Требует учета особенностей адаптации для различных белков-приманок, уровней экспрессии и субклеточной локализации.
- Включает практические ограничения, такие как потенциальное влияние тега и необходимость оптимизации времени индукции и условий лизиса.
