Оценка данио рерио функции почек с помощью флуоресцентного Зазор Пробирной

Общая цель данной процедуры заключается в разработке количественного метода анализа функции почек у данио-рерио. Для этого сначала эмбрионы данио-рерио на стадии 72 HPF подвергают анестезии. Затем эмбрионы переносят в форму для инъекций и ориентируют так, чтобы их сердца находились в левой части поля зрения.

Затем в полость перикарда вводят флуоресцентный краситель румин-декстра, после чего с помощью эпифлуоресцентного диссекционного микроскопа получают флуоресцентные изображения области сердца. В завершение с помощью эпифлуоресцентной микроскопии оценивают почечный клиренс флуоресцентного красителя. Основным преимуществом данного метода является получение количественных данных о функции почек zebrafish без необходимости проведения анализов крови или мочи, которые невыполнимы для zebrafish.

Данный метод представляет собой эффективный инструмент для оценки функции почек в моделях заболеваний у zebrafish. После извлечения игл и подготовки формы согласно текстовому протоколу, залейте форму, предварительно налив 2% раствор агарозы, приготовленный на рыбной воде, в чашку Петри диаметром 90 мм. Поместите форму в чашку Петри так, чтобы края многослойного предметного стекла погрузились под углом под поверхность агарозы.

Оставьте для застывания на 30 минут. Снимите форму для предметного стекла и используйте свежую воду для рыб, содержащую анестетик трикаин в соотношении 1:25. Накройте предметное стекло с отпечатком рыбок для проведения инъекций флуоресцентного красителя в зебра-рыбок.

Используйте стандартную установку для микроинъекций, состоящую из воздушного компрессора, подключенного к системе регулятора давления, которая подает воздух в прямой держатель пипеток для капилляров с внешним диаметром 1,0. Держатель пипеток должен быть размещен внутри компактного модуля MN 33. Для визуализации, манипуляций и инъекций в эмбрионы используйте трехкоординатный микроманипулятор, закрепленный на стальной опорной плите с помощью магнитного штатива, и диссекционный микроскоп, поддерживая стандартные условия содержания Danio rerio, изложенные в текстовом протоколе.

Используйте линии zebrafish дикого типа или трансгенные линии в зависимости от целей эксперимента. Поддерживайте плотность посадки 15 самцов и 15 самок на восьмилитровый аквариум, чтобы обеспечить максимальный сбор икры, не беспокоя рыб. Погрузите нерестовые аквариумы в аквариумы с популяцией дикого типа накануне вечером перед сбором.

В день сбора дайте рыбам 30–40 минут для нереста. Затем с помощью сита с сеткой и свежей аквариумной воды соберите и промойте икру. Поместите очищенные икринки в чашку Петри диаметром 90 мм с эмбриональной средой и инкубируйте при 28,5 °C для ингибирования миогенеза.

Через восемь часов после оплодотворения (HPF) перенесите жизнеспособные эмбрионы в минимальном объеме жидкости в новые чашки Петри, содержащие 1-100 ПТУ в среде для эмбрионов, и продолжите инкубацию при температуре 28.5 °C.

Используйте тонкий пинцет, чтобы отломить кончик иглы. Затем переместите RD к кончику иглы, установив максимальную длительность импульса в режиме минут. Когда раствор достигнет кончика, переключитесь обратно на миллисекунды.

Поместите микрометр на предметный столик микроскопа и с помощью регулятора давления и подстройки кончика иглы доведите размер вытесняемой капли до 100 микрон в диаметре или объема 0.5 нанолитров перед инъекцией. Подготовьте две чашки Петри диаметром 35 миллиметров, в каждую из которых налейте пять миллилитров среды для эмбрионов; одну из них пометьте как «трика», а другую — как «восстановление».

Добавьте 200 µL стокового раствора трикаина в чашку с соответствующей маркировкой. Когда будете готовы к инъекции, выберите отдельный эмбрион на стадии 72 HPF. Перенесите эмбрион с минимальным количеством жидкости в чашку с трикаином и наблюдайте за его активностью.

После анестезии эмбриона перенесите его в форму для инъекций и расположите в желобе так, чтобы левая сторона была обращена вверх. Расположите сердце в левой части поля зрения. Чтобы ввести RD в сердце, используйте иглу для прокалывания перикарда и введите 1 nanoliter RD в полость перикарда.

После извлечения иглы перенесите инъецированный эмбрион в минимальном объеме жидкости в чашку для восстановления и наблюдайте за ним в течение одной минуты. Затем перенесите каждый отдельный эмбрион в 24-луночный планшет, содержащий один миллилитр свежей среды для эмбрионов с добавлением PTU, и соответствующим образом промаркируйте лунки. После инъекции как минимум 10 эмбрионов в каждой экспериментальной группе инкубируйте их при температуре 28.5 °C в течение трех часов.

Через три часа после инъекции (HPI) эмбрионы анестезируют, как было описано ранее. Затем их переносят в чашку Петри диаметром 35 мм с 3% метилцеллюлозой. Эмбрионов осторожно вдавливают в метилцеллюлозу и ориентируют таким образом, чтобы можно было получить изображение их латеральной стороны.

Используя эмиссионный фильтр на 570 нанометров для УФ-света, получите изображение эмбриона. Дайте эмбриону восстановиться перед тем, как вернуть его в соответствующую лунку; получите изображения всех инъецированных эмбрионов, затем продолжите инкубацию при 28,5 градусах Цельсия. После получения второго раунда изображений через 24 часа после инъекции (HP) я использую программное обеспечение ImageJ для количественной оценки интенсивности флуоресценции каждого инъецированного эмбриона путем открытия изображения и определения области интереса (ROI).

Выберите функцию «редактировать выделение» (edit selection), укажите и установите значение в 100 квадратных пикселей. Расположите сердце в центре области интереса (ROI), выберите «анализ» (analyze), перейдите в «измерения» (measurements) и настройте их так, чтобы они включали среднюю интенсивность серого и площадь. Затем выполните измерение, количественно определите флуоресценцию для каждого набора изображений через 3 HPI и 24 HPI на один эмбрион и перенесите средние значения интенсивности серого в электронную таблицу для дальнейшей обработки.

Используйте подходящее программное обеспечение для проведения статистического анализа и сравнения групп на предмет статистической значимости с помощью t-критерия Стьюдента, как показано здесь. Инъекция RD в девять рыб Morpho привела к тому, что у 40% эмбрионов к пятому дню после оплодотворения развились пронные фрик-кисты. Кроме того, у рыб morphin наблюдалось снижение способности выводить флуоресцентный краситель через 24 HPI по сравнению с контрольной группой.

Группу из 10 рыб можно инъецировать в течение 15 минут. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как использовать оптическую прозрачность zebrafish для количественного мониторинга временного клиренса микроинъецированного флуоресцентного красителя в качестве эффективного показателя функции почек zebrafish.