Оценка данио рерио функции почек с помощью флуоресцентного Зазор Пробирной

Общая цель этой процедуры заключается в проведении количественного анализа функции почек у рыб данио. Это достигается путем первой анестезии эмбрионов рыб данио при 72 HPF. Далее эмбрионы переносят в форму для литья под давлением и ориентируют так, чтобы их сердца находились слева от поля зрения.

Затем в перикардиальную полость вводится дукстер флуоресцентного красителя рубца и требуются флуоресцентные изображения сердечной области с помощью эпифлуоресцентного пресекающего микроскопа. В конечном счете, клиренс флуоресцентного красителя в почках оценивается с помощью эпифлуоресцентной микроскопии. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он дает количественное считывание функции почек рыбок данио без необходимости проведения анализов крови или мочи, что невозможно у рыб данио.

Этот метод является мощным инструментом для оценки функции почек на моделях болезней рыбок данио. После вытягивания игл и подготовки формы в соответствии с текстовым протоколом отлите форму, предварительно налив 2%-ный раствор, приготовленный в рыбьей воде, в 90-миллиметровую чашку Петри. Поместите форму на чашку Петри, позволив сложенным краям створки погрузиться под углом под поверхностью агроматериала.

Дайте ему застыть в течение 30 минут. Снимите гипс предметного стекла и используйте свежую рыбью воду, содержащую трикальный анестетик в соотношении один к 25. Для покрытия предметного стекла отпечатывается арос для выполнения рыбок данио инъекции флуоресцентного красителя.

Используйте стандартную установку микровпрыска, состоящую из воздушного компрессора, подключенного к системе регулятора давления, которая подается в прямой держатель пипетки для использования с капиллярами наружного диаметра 1,0. Держатель для дозатора должен быть размещен внутри компактного дозатора MN 33. Трехосевой управляемый микроманипулятор закреплен на стальной опорной плите с помощью магнитной подставки, препарирующей микроскоп для визуализации, манипулирования и введения эмбрионов при сохранении рыб данио в стандартных условиях, изложенных в текстовом протоколе.

Используйте лески дикого типа или трансгенные рыбки данио в зависимости от эксперимента. Поддержание плотности посадки от 15 до 15 самок на восьмилитровый аквариум, чтобы обеспечить сбор максимального количества икринок без беспокойства рыб. Погрузите резервуары для разведения в резервуары дикого типа вечером накануне сбора.

В день сбора дайте рыбе от 30 до 40 минут, чтобы она нерестилась. Затем используйте сетчатое ситечко и свежую аквариумную воду для сбора и промывки икры. Поместите очищенные яйца в 90-миллиметровую чашку Петри, содержащую эмбрион, среду и инкубируйте при температуре 28,5 градусов Цельсия, чтобы подавить миогенез.

В восемь часов. После внесения удобрений или ВПЧ. Перенесите жизнеспособные эмбрионы в минимальном количестве жидкости в свежие чашки Петри, содержащие от одного до 100 ПТУ в среду для эмбрионов, и далее инкубируйте при температуре 28,5 градусов Цельсия.

С помощью щипцов с тонкими наконечниками сломайте конец иглы. Затем переместите RD к кончику иглы, максимизировав длительность импульса до минуты. Когда решение достигнет кончика, переключитесь обратно на миллисекунды.

Поместите микрометр на предметный столик микроскопа и с помощью регулятора давления и уточнений на кончике иглы отрегулируйте размер вытесняемой капли до 100 микрон в диаметре или объема 0,5 нанолитра перед инъекцией. Установите 2 35-миллиметровые чашки Петри. Каждый из них содержит пять миллилитров эмбриональной среды, одну трику и другую восстановительную.

Добавьте 200 микролитров бульонной трики в форму с маркировкой трики. После того, как вы будете готовы к инъекции, выберите отдельный эмбрион при 72 HPF. Переливайте минимальное количество жидкости в чашку для трики и следите за активностью эмбриона.

Как только эмбрион будет обезболиван, перенесите его в форму для литья под давлением и расположите в кормушке так, чтобы левая сторона была обращена вверх. Расположите сердце в левой части поля зрения. Чтобы ввести ПД в сердце, с помощью иглы прокалывают перикард и вводят один нанолитр ПД в полость перикарда.

После извлечения иглы перенесите введенный эмбрион в минимальном количестве жидкости в чашку для восстановления и наблюдайте за ним в течение одной минуты. Затем перенесите отдельный эмбрион в 24-луночный планшет, содержащий один миллилитр свежей эмбриональной среды, содержащей ПТУ, и нанесите соответствующую этикетку. После введения не менее 10 эмбрионов в каждой опытной группе инкубируют при температуре 28,5 градусов Цельсия в течение трех часов.

Через три часа после инъекции или HPI обезболили эмбрионы, как описано ранее. И переложить в 35-миллиметровую чашку Петри, содержащую 3% метилцеллюлозы. Осторожно вдавите эмбрионы в метилцеллюлозу и сориентируйте так, чтобы можно было визуализировать боковую сторону.

Используя эмиссионный фильтр 570 нанометров для ультрафиолетового излучения, получить изображение эмбриона. Дайте эмбриону восстановиться, прежде чем заменять его в предназначенной лунке, получите изображения для всех введенных эмбрионов, затем продолжайте инкубацию при температуре 28,5 градусов Цельсия. После получения второго раунда изображений при 24 HP я использую программное обеспечение image J для количественной оценки интенсивности флуоресценции каждого введенного эмбриона, открывая изображение и указывая область интереса или ROI.

Выбрав «Редактировать выделение», укажите и установите значение на 100 квадратных пикселей. Поместите сердце в центр ROI и выберите «Анализировать», установите измерения и установите измерения, чтобы включить среднее значение шкалы серого и площадь. Затем проведите измерение, количественно оцените флуоресценцию для каждого набора изображений на уровне трех HPI и 24 HPI на эмбрион и перенесите средние значения оттенков серого в электронную таблицу для дальнейшей обработки.

Используйте соответствующее программное обеспечение для выполнения статистического анализа и сравнения групп по статистической значимости с использованием Т-критерия учащегося, как показано здесь. Инъекция RD в bbbs девяти рыб, введенных Morpho, привела к тому, что у 40% эмбрионов развились склонные кисты фрика к пяти дням после оплодотворения. Кроме того, у рыб морфина наблюдалось снижение способности выводить флуоресцентный краситель после 24 HPI по сравнению с контрольной группой.

Один раз необходимо ввести группу из 10 рыб в течение 15 минут. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как использовать преимущества оптической прозрачности рыбок данио для количественного контроля временного клиренса микроинъекционного флуоресцентного красителя в качестве эффективного считывания функции почек рыбок данио.