Используя специально разработанный гальванотаксис палаты по изучению направленной миграции из клеток простаты

Общей целью этой процедуры является проведение Galvan Axxis, анализа для оценки направленной миграции клеток в приложенном электрическом поле. Это достигается путем предварительной сборки, а затем засеивания камеры Galvan axxis с интересующими элементами. На втором этапе камера герметизируется и подается электрическое поле для покадровой съемки.

На последнем этапе отслеживается скорость миграции отдельных клеток и угол относительно электрического поля. В конечном итоге соавторствовать. С его помощью можно показать, как клетки реагируют на электрическое поле и мигрируют ли они в направлении к катоду.

Основным преимуществом этого метода являются легкость извлечения клеток после вторичного анализа и легкость, с которой миграция может быть снята при большом увеличении и с помощью флуоресцентно меченных клеток. Визуализация данного метода имеет решающее значение, так как этапы сборки камеры сложно освоить без демонстрации сборки донных камер. Начните с протирки пластиковой гальванической камеры с двумя пропанолами.

Затем с помощью шприца нанесите морской силиконовый герметик вокруг круглых отверстий на нижней стороне камеры. Наденьте на герметик большое покровное стекло и прижмите его на место концом ватного аппликатора, смыв излишки клея ватным тампоном. Затем с помощью алмазного маркера вырежьте небольшое покровное стекло, чтобы сделать шесть на 25 миллиметров, и переверните камеру.

Затем с помощью шприца нанесите две полоски силикона, создав поверхность канала размером 10 на 25 миллиметров для прикрепления клеток между двумя круглыми отверстиями на нижнем стекле. Затем склейте два стеклянных пространства между круглыми отверстиями, надавливая на них новым ватным аппликатором и стирая излишки клея, как показано только что на рисунке. Попробуйте использовать камеру в течение 24 часов, пока силиконовый клей не затвердеет.

На следующий день замочите камеру в дистиллированной воде на ночь, чтобы удалить остатки уксусной кислоты из клея, прежде чем засевать клетки в камеру. Высушите и протрите камеры двумя пропанолами, как только что продемонстрировано. Промойте их стерильным PB S3 раза, а затем проверьте поток жидкости между двумя круглыми отверстиями в камерах.

Убедившись, что камеры находятся в хорошем рабочем состоянии, заключите их в стерильные чашки для культуры и поместите камеры при температуре 37 градусов Цельсия на 15 минут. Пока камеры находятся в равновесном состоянии, отделите клетки предстательной железы от их чашки для культивирования пятью миллилитрами трипсина ЭДТА при температуре 37 градусов Цельсия. Через пять минут нейтрализуйте реакцию пятью миллилитрами 10% FBS.

В PBS переложите отделенные клетки в пробирки объемом 15 миллилитров, а затем центрифугируйте в течение пяти минут. При 200 разах G аспирируйте среду, а затем повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре среды. Затем, после подсчета клеток, отрегулируйте концентрацию клеток до восьми на 10 до четырех клеток на миллилитр с помощью питательной среды и семян.

По 350 микролитров клеточной суспензии на каждую камеру. Инкубируйте клетки в камере на ночь в чашке для культивирования с влажной салфеткой Кима при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. На следующий день начните сборку верхних камер, предварительно прогрев 10 миллилитров культуры, средней до 37 градусов Цельсия для каждой гальванической камеры AXS.

Пока среда нагревается, перенесите камеру Galvan axxis из инкубатора на нагревательную пластину с температурой 37 градусов Цельсия и промойте камеру питательной средой. Чтобы удалить неприкрепленные ячейки, оставьте в камере 400 микролитров среды, а затем с помощью шприца нанесите высоковакуумную смазку поверх обоих стеклянных пространств. Запечатайте камеру покровным стеклом и ватным аппликатором, а затем высушите поверхность стекла.

Затем нанесите смазку для высокого вакуума с помощью шприца, чтобы закрыть зазор между покровным стеклом и камерой. А затем добавьте питательную среду во внутренние водоемы. Удалите пузырьки и проверьте расход жидкости между резервуарами.

Чтобы сделать агаровые мосты, вырежьте пару двухдюймовых трубок из ПВХ, переверните их, а затем поместите кусочки в стакан объемом 100 миллилитров. Затем добавьте 200 миллиграммов агара для пальцев ног bact в колбу объемом 50 миллилитров с 10 миллилитрами питательной среды, чтобы получился гель 2%-ного агара. После разогрева в микроволновой печи в течение 30 секунд с помощью пипетки для переноса загрузите агаровый гель в пластиковую трубку и оставьте агаровые мостики при комнатной температуре на 10 минут, чтобы агар затвердел.

Затем добавьте два миллилитра питательной среды во внешние резервуары гал-камеры и вставьте агаровые мостики во внутренние и внешние резервуары среды, чтобы провести ток для выполнения покадровой визуализации миграции. Начните с переноса камеры Galvan в климатическую камеру с температурой 37 градусов Цельсия на предметном столике микроскопа, закрепив камеру лентой и сфокусировавшись на ячейках под объективом с 10-кратным увеличением. Затем вставьте электроды Galvan Axxis во внешние резервуары с катодом с правой стороны, закрепив провод и электроды лентой.

Затем включите блок питания, чтобы подать электрическое поле на камеру, и с помощью измерителя напряжения измерьте выходное напряжение по всей камере, чтобы достичь 2,5 вольт для камеры длиной 25 миллиметров. Теперь выберите 10 точек в камере для создания 10 таймлапс-фильмов и установите условия съемки с интервалом в 10 минут в течение двух часов. Затем начните съемку и отрегулируйте выходной ток по мере необходимости, чтобы поддерживать напряженность поля во время эксперимента.

В конце эксперимента снимите камеру со сцены и закрепите клетки в 95% спирте. Затем разломайте камеру. Чехол можно сохранить на потом.

Окрашивание и визуализация. Очистите камеру на будущие годы. Чтобы количественно оценить Galvan Axxis, поворачивайте интервальные видеоролики так, чтобы катод был ориентирован на верхнюю часть изображений.

Экспортируйте фильмы в программное обеспечение для отслеживания ячеек и вручную отслеживайте положение XY от 10 до 20 ячеек в каждой временной точке из каждого фильма, расстояния миграции и углы относительно направления север-юг, та же ориентация электрического поля будет рассчитана в программном обеспечении для отслеживания ячеек. Наконец, сохраните измерения и импортируйте данные в приложение базы данных для расчета объединенных результатов. В этом репрезентативном эксперименте Galvan Axxis было установлено, что линии клеток предстательной железы мигрируют с одинаковой скоростью в течение двух часов.

Тем не менее, направленность к электрическому полю составила 0,7 плюс минус 0,3 для ПРНС на одну линию и 0,2 плюс минус 0,8 для ПНТ на две линии, что указывает на значительную разницу в оси Гальвана этих двух клеточных линий, предполагая их клеточные сигнальные механизмы прямых дифференциальных миграционных реакций на электрическое поле. Этот метод помогает исследователям изучить механизмы направленной миграции клеток в электрополе.