Последовательность конкретных Маркировка нуклеиновых кислот и белков с метилтрансферазы и кофактора аналогов

Общая цель следующих экспериментов состоит в том, чтобы специфически помечать ДНК и белки с помощью метилтрансфераз, которые естественным образом переносят активированную метильную группу и кофактор Sile l метионин, называемый aome, в D-N-A-R-N-A. Белки или небольшие биомолекулы. Одноступенчатое мечение достигается путем замены природного кофактора опущения на синтетические аиновые кофакторы, которые изменяют ход реакции, приводящей к ферментативному связыванию всего кофактора и, следовательно, ковалентному мечению последовательности субстрата Показано специфическое метилтрансфераза-индуцированное метилтрансферазой специфическое мечение ДНК с помощью адин-специфичной ДНК-метилтрансферазы, M-B-S-E-C одной, который связывает биотинилированный кофактор Aine 6 BAZ с последовательностью узнавания A-G-C-G-A-T, приводящей к последовательности, в частности, биотинилированной, направленной ДНК-метилтрансферазой активированных групп, является использованием белка-метки и демонстрируется с использованием набора MTA семь девять, который переносит про парго-группу с C 8 oin на лизин четыре гистона H три.

Алкилированный остаток лизина химически мечается модифицированным ази фтором с использованием катализируемой медью клик-химии, что приводит к получению специфически меченого белка. Преимущество использования метамфетаминовых трансфераз для мечения заключается в том, что они могут напрямую нацеливаться на нативные субстраты. Я продемонстрирую это с помощью секвенционно-специфической биоТЭ элизации плазмиды, ДНК-метамфетаминовой трансферазы, катализируемой модификации белка с помощью кофактора аналога зина и позволяет вводить широкий спектр репортерных групп в два этапа.

Я продемонстрирую это с помощью флуоресцентного мечения белка hisone H 3 и покажу результаты мечения H 3 биотином. Кроме того, двойные активированные аналоги кофактора могут быть легко синтезированы путем загрузки S ail, el гомоцистеина, продукта кофактора после переноса метильной группы различными активированными спиртами. Синтетические аналоги кофактора очищаются с помощью ВЭЖХ с обратной фазой, а в некоторых случаях даже удается отделить эпи Марса на серу.

Улыбающаяся ДНК — это последовательно-специфическая метилтрансфераза, индуцированная мечением ДНК. Здесь эта концепция демонстрируется путем маркировки плазмидной ДНК PB 3 22 шестью кофакторами BAZ Aine и метилтрансферазой адин-специфичной ДНК. M-B-S-E-C начинают с того, что простреливают шесть баз при температуре 20 градусов по Цельсию.

Подумав, восстановите реакционную смесь на льду. Он включает в себя микрограмм плазмиды, 60 микромоляров шести БАЗ и 10 эквивалентов одного M-B-S-E-C. Узнавающая последовательность HER на ДНК в буфере модификации.

Обязательно добавьте шесть БАЗ и M-B-S-E-C напоследок. Убедитесь, что AME не связан с метамфетаминовой трансферазой, которую вы используете, потому что естественный кофактор будет блокировать мечение. React For controls.

Замените MTA водой, чтобы визуализировать любые неспецифические модификации кофактора, и добавьте воду вместо кофактора, чтобы проверить наличие естественного кофактора в концентрате фермента. Теперь аккуратно перемешайте реакции с помощью пипетки и выдержите их при температуре 55 градусов Цельсия в течение часа. Ближе к концу инкубации восстановите эндонуклеазную смесь на льду, добавив 10 микролитров 10 x рекомбинантного тача, один буфер на 80 микролитров воды, а затем добавив 3,3 микролитра рекомбинантного така одной эндонуклеазы рестрикции.

После инкубации проведите реакции с помощью быстрого вращения, а затем проверьте модификацию ДНК в каждой из них. Добавьте два микролитра 10 х так, один буфер и 28 микролитров смеси эндонуклеазы. Перемешайте реакции с помощью аккуратного пипетирования.

Теперь инкубируйте реакции при температуре 65 градусов Цельсия в течение получаса. Когда реакции закончатся, вытяните раствор с быстрым вращением и соберите 25 микролитров реакций в новые пробирки. К этим аликвотам добавьте 2,4 микролитра стрептококкового TTR в буферизованном по одному миллимоляру на мономер стрептококкового адина.

Теперь инкубируйте эту реакцию в течение часа при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации добавьте пять микролитров шести загрузочных буферов к завершенным реакциям и выведите 10 микролитров на 1%-ный гель агрос при 80 вольт в течение примерно часа. Затем визуализируйте полосы mt A — это аббревиатура от метилтрансферазы, направленной передачи активированных групп.

В этой демонстрации метилтрансфераза установила семь, девять и дважды активированный кофактор С восемь. Oin используется для обозначения лизина четыре из его гистона H три. После размораживания компонентов на ледовой реакции 20 мкм реакционных смесей, раствор анализа содержит модификационный буфер 10 мкм гистона Н трех и добавляется последний 10 мкм метилтрансфераз плюс 600 мкм кофактора.

Произведите ферментный контроль, заменив C eight ON на деионизированную воду. Также сделайте кофакторный контроль для визуализации неспецифических модификаций путем включения 60 миллимоляров ADO met для конкуренции с синтетическими кофакторами. Теперь смешайте реакции с медленным вредителем труб и проверьте их pH с помощью тест-полосок. Двойные активированные аналоги кофактора сохраняются в условиях С.

Таким образом, pH вашего реакционного раствора может измениться при необходимости при добавлении софактора в небольших количествах 50 миллимолярного гидроксида натрия для регулировки pH. Теперь инкубируйте реакции при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов во время ремонта инкубации. Непосредственно перед окончанием инкубации приготовьте 12% полиакриламидный гель SDS, приготовьте 20 микролитров смеси из пяти кликов, содержащей три миллимоляра сульфата меди, три миллимоляра лиганда T-H-P-T-A 250 миллимоляров, натриевую приманку ACO и шесть миллимолярных азидов тамары.

В конце инкубации добавьте пять микролитров клик-смеси в каждую реакцию и медленно перемешивайте реакции по мере поглаживания. Защитите реакции от света с помощью фольги и выдержите их при температуре 20 градусов Цельсия в течение часа. Через час удалите излишки хлороформа, осадив белки.

Добавляйте 75 микролитров метанола, 18,7 микролитров хлороформа и 50 микролитров воды в каждую реакцию и кратковременно делайте их вихревыми после каждого добавления. После подготовки каждой трубки закрутите их при 16 000 G в течение пяти минут. Удалите верхнюю фазу разделения, не нарушая интерфейсный слой, в котором находятся белки.

Теперь добавляем 56,3 микролитра метанолов, нижнюю фазу и вихрь. Затем убавьте его, чтобы слить белок, и выбросьте супинат. Затем добавьте 56,3 микролитра метанола.

Опять же, вихрь. Повторите вращение и соберите гранулы. Дайте гранулам высохнуть в трубках, без крышек и накрытых безворсовой бумагой.

Позже растворите белки в 20 микролитрах загрузочного буфера SDS с загрузочным красителем. Промойте стенки трубки с буфером, чтобы собрать гранулы. Затем инкубируйте пробирки при температуре 95 градусов Цельсия в течение 10 минут.

После того, как пробирки поднимутся до комнатной температуры, потратьте их на короткое время, чтобы извлечь их содержимое и визуализировать белки по странице SDS. Работайте при напряжении 120 вольт около 90 минут. Реакцию улыбки проводили с ДНК-метилтрансферазой M-B-S-E-C, которая модифицирует второй адениновый остаток в двухцепочечной последовательности A-T-C-G-A-T и имеет один сайт узнавания на плазмиде PBR 3 2 2, который помечен красным цветом для тестирования плазмидного мечения.

PB 3 2 2 подвергался воздействию рекомбинантной рестрикции ENDONUCLEASE T one, которая имеет семь сайтов на PB 3 22, отмеченных зеленым цветом, один из которых входит в состав M-B-S-E-C one. При нанесении меток этот участок следует беречь от расщепления в геле. Это подтвердилось.

Появился новый фрагмент с 683 парами оснований, свидетельствующий о наличии маркировки на одном участке M-B-S-E-C. Это видно только на пробирной полосе, которая является третьей дорожкой. Специфичность реакции мечения была продемонстрирована с помощью электромоторного сдвига.

При добавлении стрепт-адина электроподвижность фрагмента 683 пары оснований, меченного биотином, замедлялась. При этом подвижность фрагментов без M-B-S-E-C оставалась неизменной или двухэтапное мечение метилтрансферазных субстратов двойным образом активировалось восемью метическими аналогами. Использовали гистон H three lysine four метилтрансфераза набора семь девять и малый кофактор C eight ON.

Гель-электрофорез использовался для обнаружения флуоресценции только на полосе анализа. Первая полоса показала флуоресцентную полосу, соответствующую гистону Н-3, что указывает на то, что боковая цепь кофактора была специфически перенесена, и модифицированный белок был помечен Tamara Flora. Морилка ESI служит для контроля нагрузки.

Все дорожки показали одинаковое количество белка. Субстраты метилтрансферазы также могут быть помечены биотиновыми реакциями с биотином, полученным из ази. Вместо фтористого вещества были проведены анализы методом вестерн-блоттинга с пероксидазой хрена.

Конъюгированная Аден успешная и специфическая маркировка была замечена после просмотра этого видео. Вы должны хорошо понимать, как помечать ДНК и последовательность белка, в частности, текстом аффинности, силой флюора или другими метками. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что другие MET и его аналоги чувствительны к температуре.

Всегда обрабатывайте их на льду и храните при температуре минус 20 градусов по Цельсию. У меня синтезирован двойной актив. Другие аналоги MET с репортерной группой уже встроены в боковую цепь и использовали их для специфической маркировки ДНК за один этап.

Я особенно взволнован перспективой объединения различных ферментов и отчетных групп для картирования ДНК с использованием методов одной молекулы. Улыбающиеся и NEC очень гибкие, и практически любые химические группы могут быть перенесены не только в ДНК и белки, но и в РНК и малые с помощью соответствующих переносов метамфетамина.