Высокоэффективная Лигирование малых РНК молекул для микроРНК количественного путем высокопроизводительного секвенирования

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы непредвзято подготовить микроРНК к высокопроизводительному секвенированию. Это достигается путем предварительного получения или покупки олигонуклеотидов ДНК, которые способны к лигированию к трем основным концам микроРНК. Второй шаг заключается в лигировании трех основных олигонуклеотидов ДНК к трем основным концам микроРНК.

Затем продукт лигирования очищают гелем и лигируют олигонуклеотидный линкер с пятью первичными РНК к пяти основным концам микроРНК. Заключительным этапом является превращение гибридных молекул в КДНК и последующая амплификация КДНК с помощью полимеразной цепной реакции. В конечном счете, клонирование микроРНК и высокопроизводительное секвенирование используются для количественного отображения широкого профиля микроРНК транскриптома с разрешением отдельных нуклеотидов.

Основное преимущество нашего метода перед существующими методами, такими как микросеквенирование микролучей количественной ПЦР-блоттинга, заключается в том, что наш метод лучше отражает фактический уровень микроизлучения в широком лабораторном масштабе транскрипта при разрешении одного нуклеотида. Хотя этот метод может дать представление о биологии микроРНК, он также может быть применен к другим высокопроизводительным технологиям секвенирования, таким как HC clip и RNA-Seq. ДНК-олигонуклеотиды для этой процедуры предназначены для трех реакций первичного лигирования и должны иметь пять основных фосфатных групп, рандомизированный динуклеотид на пяти простых концах и трехпервичный цитозин, разбавляющий олигонуклеотиды ДНК до 100 микромоляров в воде, свободной от нуклеазы.

Соберите вентиляционную реакцию, объединив эти реагенты с 200 пико-молями трех основных линкерных олигонуклеотидов, четырьмя микролитрами пяти первичных вентиляционных буферов DNAA, четырьмя микролитрами TP, четырьмя микролитрами M-T-H-R-N-A, лигазой и нуклеазой свободной воды до конечного объема 40 микролитров. Инкубируйте реакцию при температуре 65 градусов Цельсия в течение одного часа. Прекратить реакцию путем нагревания до 85 градусов Цельсия в течение пяти минут.

Осадите линкер TED, добавив 2,5 объема 100% этанола и одну треть объема 10 молярного ацетата аммония. Чтобы удалить остаточный ТП и предотвратить непредвиденные лигирования в будущих реакциях, смешайте спирт, соль и раствор олигонуклеотида до однородности, вращая на полной скорости в микроцентрифуге при температуре четыре градуса Цельсия в течение 20 минут. Промойте гранулу в воздухе с 70% этанолом, высушите и повторно суспендируйте гранулу в соответствующем объеме воды, не содержащей нуклеаз, чтобы получить от 50 до 100 микромолей вентилируемого олигонуклеотида.

Подтвердите вентиляцию олигонуклеотида с помощью электрофореза на 18%-ном полиакриламидном геле. Предварительно запустите гель в течение 30 минут при ширине геля 24 вольта сантиметра с одним рабочим буфером XTBE при комнатной температуре. По истечении 30 минут промойте лунки с помощью работающего буфера.

ДНК-олигонуклеотиды для этой процедуры предназначены для трех реакций первичного лигирования и должны иметь пятипервичную фосфатную группу, рандомизированный динуклеотид на пяти простых концах и трехпрайм-окситоцин. Разбавьте олигонуклеотиды ДНК до 100 микромоляров в воде, свободной от нуклеазы. Запускайте гель при напряжении 24 вольта на сантиметр до тех пор, пока бромофенольный синий не окажется на трех четвертях пути к нижней части гелевого столба.

Окрасьте гель одним раствором кибер-золота в одном XTBE и визуализируйте на коробке с ультрафиолетовым транслюминатором. Должен произойти один нуклеотидный сдвиг в размере олигонуклеотида ДНК, который подвергался вентиляции с помощью M-T-H-R-N-A лигазы для реакции лигирования трех первичных чисел. Соберите следующие компоненты на льду в таком порядке.

Один микролитр 50% PEG 8, 000 0,5 микролитров 10 XRNA лигазы буфера. Один микролитр вентилируемого трехпрайм-линкера, 0,5 микролитра РНК-ингибитора от 0,5 до 8 микрограммов общей РНК, 0,5 микролитра Т-четырех РНК-лигаз, два и вода, свободная от нуклеаз, до конечного объема в пять микролитров. Перемешайте реакцию пипеткой после тщательного перемешивания.

Поместите реакцию в термоамплификатор с нагретой крышкой. Установите блок на 16 градусов Цельсия и выдерживайте в течение четырех часов. Следует отметить, что реакцию можно масштабировать до конечного объема в 20 микролитров без потери эффективности лигирования.

После трех простых лигирования смешайте реакцию с равным объемом двух XRNA при загрузке буфера до 70 градусов Цельсия в течение пяти минут и охладите на льду. Далее гель. Очистите образец на 15% полиакриламидном геле.

Предварительно запустите гель при напряжении 24 вольта ширины геля не менее 30 минут. Выключите электропитание и промойте колодцы с помощью работающего буфера. Загрузите образец и запустите гель с тем же напряжением, что и перед запуском, пока бромфенол не выйдет из геля.

Желаемый продукт будет мигрировать близко к ксилоловому голубому цвету, когда электрофорез полиакриламидного геля будет завершен. Поместите гель в чистый лоток с одним буфером для работы и одним x cyber gold and rock на 15 минут. Снимите гель с формы для окрашивания и визуализируйте на коробке с УФ-транслюминатором, накрытой чистой полиэтиленовой пленкой.

Продукт лигирования должен иметь длину около 45 нуклеотидов. Поскольку этот продукт лигирования обычно не виден, важно включить положительный контрольный образец синтетической РНК в соседнюю полосу с использованием чистого бритвенного лезвия exci, область, содержащую продукт лигирования. Ориентируются на позиции образца синтетической РНК и нормы размера.

Поместите фрагмент акцизного геля в микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 миллилитров. Проткните дно микроцентрифужной пробирки объемом 0,5 миллилитра иглой 30 калибра и поместите прокол во вторую чистую микроцентрифужную пробирку с низким удержанием объемом 1,5 миллилитров на пять минут примерно 15 000 раз. G.Визуально подтвердить, что весь гелевый срез переместился через отверстие во внутренней трубке.

При необходимости используйте чистый наконечник для пипетки, чтобы протолкнуть фрагменты геля ближе к отверстию. Выбросьте пустой тюбик объемом 0,5 миллилитра и добавьте 400 микролитров буфера с высоким содержанием соли в акриламидную суспензию. Прокачайте трубку при температуре четыре градуса Цельсия в ночь на следующий день.

Перенесите суспензию в спиновую колонку из ацетата целлюлозы 0,22 микрона с помощью центрифуги с широким отверстием для пипетки в течение трех минут при комнатной температуре примерно 15 000 раз. G, чтобы собрать всю жидкость подальше от матрицы акриламидного геля. Переложите жидкость в чистую пробирку с низким удержанием объемом 1,5 миллилитра, содержащую один микролитр раствора гликогена 20 миллиграмм на миллилитр.

Добавьте равный объем изопропанола и одну 10-ю часть ацетата натрия и перемешайте раствор, несколько раз перевернув пробирку. Высадить в осадок в морозильной камере при температуре минус 80 градусов Цельсия на 20 минут. Центрифугируйте на полной скорости при температуре четыре градуса Цельсия в течение 20 минут.

Чтобы гранулировать нуклеиновую кислоту, удалите ее и промойте на воздухе, содержащем 70% этанол. Высушите гранулу в течение 10 минут при комнатной температуре и приступайте непосредственно к пяти основным этапам лигирования. Чтобы начать эту процедуру, добавьте к гранулированной ранее нуклеиновой кислоте следующие компоненты: два микролитра ПЭГ, 8 000 0,5 микролитра буфера РНК-лигазы, 0,5 микролитра ТП, 0,5 микролитра линкера, олигонуклеотид РНК и воду до конечного объема в четыре микролитра.

Перемешайте этот образец, многократно пипетируя вверх и вниз в течение пяти минут, чтобы убедиться, что гранула полностью растворилась. Как только гранула окажется в растворе, перенесите содержимое в чистую ПЦР-пробирку, содержащую один микролитр смеси РНК-ингибитора и Т-четырех РНК-лигаз, одну смешанную пипетированием вверх и вниз. Инкубируйте реакцию в термоамплификаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение четырех часов.

Когда реакция завершена, немедленно приступают к синтезу CD NA, как описано в тексте протокола, после линкерного лигирования на три основных конца РНК и страничного анализа реакций. В области геля от 100 до 300 нуклеотидов видны острые полосы с высокой молекулярной массой, что указывает на высокое качество используемого общего образца РНК. Очень яркий сигнал на 25-нуклеотидной области геля представляет собой избыток нелигированной синтетической РНК с тремя основными линкерами, что указывает на лигирование, выполненное пятью пикомолами синтетической микроРНК и тремя основными линкерами, которые были очищены гелем.

Здесь показана авторадиограмма трех реакций первичного лигирования, выполненных с использованием P 32 5 прайм и меченой синтетической микроРНК. Количество часов, в течение которых реакция могла протекать, указано вверху, а цифры внизу указывают на количество лигированного в процентах от суммы нелигированного и лигированного. Эта авторадиограмма представляет собой пять реакций первичного лигирования, выполненных с помощью P 32 5 меченых на простом конце синтетических микроРНК трех гибридов прайм-линкера.

Цифры внизу указывают на количество лигированного в процентах от суммы нелигированного и лигированного и раскрывают важность использования высокой концентрации ПЭГ 8 000 малых R-N-A-D-N-A. Библиотеки, совместимые с высокопроизводительным секвенированием, впоследствии генерируются с помощью ПЦР. Правильное количество циклов ПЦР определяется опытным путем.

В этом примере размер ожидаемого продукта ДНК составляет 146 пар оснований. При выполнении этой техники важно помнить, что все наконечники и пробирки должны быть свободны от РНК.