Электрофоретической подвижности сдвига анализа (EMSA) по изучению РНК-белковых взаимодействий: ИРЭ / IRP примера

Общая цель данного эксперимента заключается в анализе взаимодействия белков РНК из клеточных экстрактов с помощью анализа сдвига электрофоретической подвижности. Это достигается за счет того, что сначала готовят белковый экстракт из клеток или тканей на отдельном этапе, синтезируют и очищают генспецифический радиометеный РНК-зонд. Затем белковый экстракт смешивают с меченым РНК-зондом, чтобы обеспечить образование специфических белковых комплексов РНК.

Наконец, продукт реакции загружают в неденатурирующий полиакриламидный гель и анализируют с помощью электрофореза зонд свободной РНК, отделяемый от белковых комплексов РНК благодаря его более высокой подвижности. Электрофоретический анализ сдвига подвижности широко используется для анализа взаимодействий белков РНК. Мы смогли проанализировать связывание регуляторных белков железа, IRP 1 и IRP 2 с их целевым элементом РНК.

Но этот метод также может быть применен для изучения других РНК-связывающих белков, демонстрируя, что эта процедура будет выполнена доктором Кейном, филиппинским научным сотрудником в моей лаборатории, и доктором Николь Уилкинсон, научным сотрудником For Adhesive Cells, выращенных в чашках. Дважды промойте клетки ледяным PBS, затем добавьте один миллилитр ледяного PBS и соберите клетки с помощью пластикового скребка для клеток. Переложите суспензию с рассыпчатыми ячейками в свежую центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Поместите пробирку в предварительно охлажденную микроцентрифугу с температурой четыре градуса Цельсия. Вращайтесь на низкой скорости в течение пяти минут и аспирируйте суп. Клетки будут выглядеть в виде белой гранулы на дне пробирки.

На каждые 10 миллионов собранных клеток добавьте 100 микролитров ледяного буфера для лизиса цитоплазмы. Разрыхлите клеточную гранулу путем пипетирования вверх и вниз несколько раз, а затем инкубируйте суспензию на льду в течение 20 минут. Это позволит растворить клеточную мембрану и высвободить все цитозольное содержимое в буфер.

Чтобы изолировать растворенную цитозольную фракцию, пробирку на полной скорости в течение 10 минут в центрифуге с температурой 4 градусов Цельсия переложите осветленную пробирку в новую пробирку объемом 1,5 миллилитра на льду и выбросьте гранулу. Далее определяют общую концентрацию белка полученного цитоплазматического экстракта с помощью анализа Брэдфорда. Распределите полученный цитоплазматический экстракт по более мелким пробиркам и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия до использования для получения цитоплазматических экстрактов из свежих тканей.

Начните процесс сбора урожая, положив усыпленное животное на чистую подушку над препарирующей доской. Вскройте живот ножницами. Удалите печень и селезенку с помощью ножниц и щипцов.

Промойте каждую салфетку примерно в 50 миллилитрах ледяного PBS, чтобы предотвратить деградацию тканей. Сразу же нарежьте скальпелем небольшие кусочки примерно в один-два кубических миллиметра без промедления. Поместите салфетки в свежую криопробирку и защелкните.

Заморозьте образец в жидком азоте. Храните замороженные салфетки при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока они не понадобятся. Начните изготовление цитоплазматического экстракта с переноса ранее замороженного образца ткани в двухмиллилитровую пробирку с плоским дном, содержащую от 250 до 500 микролитров ледяного буфера для лизиса.

Поместите наконечник тканевого гомогенизатора в трубку и включите аппарат на среднюю мощность. После 10 секунд гомогенизации немедленно поместите пробирку на лед на 20 минут, чтобы предотвратить денатурацию белка. Чтобы выделить цитозольную фракцию, раскрутите пробирку на полной скорости в течение 10 минут в центрифуге при температуре четыре градуса Цельсия, переложите осветленную надосадочную жидкость в новую пробирку объемом 1,5 миллилитра на льду и выбросьте гранулу.

Определить общую концентрацию белка полученного цитоплазматического экстракта с помощью анализа Брэдфорда. Поместите полученный цитоплазматический экстракт в более мелкие пробирки и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока он не понадобится. Прежде чем продолжить выполнение протокола, установите радиационно-безопасный рабочий стол в комплекте со счетчиком Гейгера из плексигласового щита.

Проведите цитометрический мониторинг меток на лабораторных халатах и соответствующие контейнеры для отходов, специфичных для излучения, и контейнеры для отходов, не относящихся к острым предметам. Начиная с линеаризованной плазмиды ДНК, содержащей клонированный элемент ответа на железо. В качестве шаблона настройте реакцию транскрипции РНК in vitro объемом 20 микролитров, смешав шаблонный реакционный буфер, частично радиоактивные нуклеотиды и РНК-полимеразу с пипеткой при комнатной температуре.

Чтобы начать синтез РНК, инкубируйте образец при температуре 40 градусов Цельсия в течение одного часа. Прекратите реакцию транскрипции in vitro, добавив один микролитр 0,5 моляра ЭДТА pH 8,0. Смешайте в ЭДТА, пипетируя вверх и вниз.

Теперь используйте стандартный протокол осаждения алкоголя для очистки продукта РНК. Для начала добавьте 10 микролитров ТРНК и 82,5 микролитров трехмолярного ацетата натрия при pH 5,2 в смесь для постсинтеза и вортекс. Смешивание ТРНК будет действовать как носитель осадка и увеличит конечный выход РНК для осаждения РНК.

Добавьте 273 микролитра от 95 до 100% этанола и перемешайте путем вортексирования. Дайте протекать реакции осаждения, оставив пробирку на столе на 10 минут при комнатной температуре, чтобы изолировать РНК, раскрутите пробирку в центрифуге при комнатной температуре на полной скорости в течение 10 минут. С помощью пипетки аккуратно выбросьте надосадочную жидкость и не тревожьте гранулы.

Осажденная РНК может существовать либо в виде маленькой белой гранулы на дне пробирки, либо быть невидимой невооруженным глазом. Промойте гранулы, добавив от 100 до 500 микролитров 70% этанола. Убавьте пробу на полной скорости в течение 10 минут при комнатной температуре, а затем сцедите насыпь с крышкой.

Откройте для сушки гранулу РНК, оставив пробирку открытой на скамейке на 10-15 минут. Восстановите твердую радиомеченую РНК путем добавления 100 микролитров воды, свободной от нуклеазы. Количественно оцените степень включения радиоактивных нуклеотидов, поместив раствор РНК в жидкий счетчик Eloqua.

Радиозонд помечает РНК-зонд в более мелкие пробирки и хранит при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока он не понадобится. Замороженные аликвоты можно использовать в течение трех недель до начала анализа электрофоретической подвижности, приготовьте стандартный 6%-ный неденатурирующий акриламидный гель размером не менее 16 на 16 сантиметров, чтобы обеспечить больший объем образца на линию. А для повышения механической стабильности геля подойдет такой размер.

Используйте стеклянные распорки и расчески толщиной не менее одного миллиметра. Чтобы начать анализ сдвига электрофоретической подвижности, разморозьте ранее замороженный цитоплазматический лизат и радиомеченые РНК-зонды на глазах для белкового компонента эксперимента. Разбавьте 25 мкг цитоплазматического экстракта буфером для лизиса цитоплазмы до конечного общего объема 10 мкл.

При необходимости добавьте в смесь один микролитр раствора двух ме и держите образец белка на льду. Для компонента РНК разбавьте радиомеченый зонд РНК в воде, свободной от нуклеаз, до 200 000 отсчетов в минуту на микролитр тепла, чтобы получить РНК при температуре 95 градусов Цельсия в течение одной минуты, и охладите раствор при комнатной температуре в течение не менее пяти минут. Чтобы инициировать реакцию связывания белковой РНК, добавьте один микролитр радиомеченого РНК-зонда к белковому экстракту, чтобы позволить связыванию происходить в течение 20 минут при комнатной температуре.

Для повышения специфичности анализа сдвига электрофоретической подвижности добавьте в реакцию один микролитр запаса гепарина. Если зонды с радиоактивной меткой РНК длиннее 60 нуклеотидов, добавьте еще один микролитр РНК Tone. Дайте реакции связывания продолжаться еще 10 минут при комнатной температуре, чтобы еще больше повысить специфичность и обеспечить лучшее разделение белкового комплекса РНК.

Добавьте три микролитра загрузочного буфера и перемешайте пипеткой вверх и вниз. Затем загрузите всю реакцию на 6%-ный акриламидный гель и запустите гель при напряжении пять вольт на сантиметр в течение 60 минут. Обязательно накройте аппарат надлежащей радиационной защитой.

Разберите гелевый аппарат и переложите гель на большую фильтровальную бумагу. Высушите гель с помощью вакуумного аппарата для сушки геля в темном помещении. Положите комбинацию геля и фильтровальной бумаги поверх куска.

Пленку после экспонирования проявите и высушите на воздухе пленку. Оптимальное время экспозиции может варьироваться от одного часа до ночи. Можно оценить железозависимую связывающую способность I RRP one и I RRP two с радиоактивными зондами IRE в клетках тканевых культур с переменным содержанием железа.

Таким образом, активность связывания IRE индуцируется в обедненных железом клетках, ранее обработанных дефероксамином К. Позднее. И наоборот, активность связывания IRE подавляется в клетках, обогащенных железом, ранее обработанных геманом, в клетках, обогащенных железом. Связывающая активность IRE I RRP one теряется после сборки кластера серы железа, в то время как I RRP 2 подвергается железозависимой деградации.

Кластер железных клеток IRP one может быть разрушен обработкой клеточных экстрактов 2%two me, что позволяет контролировать его спящую активность связывания IRE. Активность I РРЦ два не восстанавливается двумя me. В следующем эксперименте связывающая активность IRE I RRP one и IRP 2 в зависимости от концентрации железа в клетках оценивалась в контексте свежих тканей печени мышей с одним нокаутом типа I и I RRP с двумя нокаутами.

Данные показывают, что кормление мышей диетой с высоким содержанием железа, которая, как известно, увеличивает жировую нагрузку печени, способствует снижению связывающей активности IRE I RRP 1 и IRP 2 в экстрактах печени мышей дикого типа. I rrp два комплекса IRE перекошены наличием I RRP одного. Они легко визуализируются в экстрактах печени мышей с нокаутом I RRP

Здесь диета с высоким содержанием железа приводит к полной инактивации IRP два. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как анализировать взаимодействия белков РНК с помощью анализа сдвига электрофоретической подвижности. Помните, что качество РНК-зонда имеет решающее значение для успеха.