Одновременное Электрофизиологические Запись и Micro-инъекции агенты, ингибирующие в мозге грызунов

Общая цель данной процедуры — создать доступный инструмент для введения нейромедиаторов в верхнее двухолмие крысы с одновременным мониторингом мультиunit-активности нейронов. Это достигается путем изготовления стеклянной пипетки из стеклянного капилляра с помощью вертикального микропипеточного вытягивателя. На втором этапе в капилляр вставляется серебряная проволока так, чтобы ее часть выступала за пределы невытянутого конца.

Затем используется клей для создания герметичного соединения между стеклянной пипеткой и гиподермической иглой. Заключительные этапы включают заполнение пипетки окрашенным в голубой цвет (Chicago sky blue) раствором ГАМК, которая соединяется с микрошприцем, заполненным минеральным маслом, и фиксируется в микроинъекторе. В итоге данная конструкция для инъекций, созданная из доступных и недорогих компонентов, может быть использована для инактивации глубоких структур мозга с одновременной регистрацией нейронной активности инактивируемой области до, во время и после введения препарата.

Данный метод обладает рядом преимуществ перед другими существующими способами, такими как системы подачи давления на основе газа или фотоинъекционные системы. Во-первых, это экономически эффективный метод, позволяющий осуществлять функциональный контроль доставки препарата, что ограничивает повреждение тканей, вызванное избыточным введением. Еще одним преимуществом данной системы является возможность совместной регистрации, что обеспечивает эффективный контроль временного компонента нейрональной деактивации.

Для подготовки записывающих инъекционных пипеток сначала вытяните капилляр длиной семь сантиметров с внешним диаметром один миллиметр на вытягивателе капилляров (модель Cop Vertical Seven 20 или аналогичная). Установите нагреватель на 18, а соленоид на один. Затем, используя перчатки, вручную обломите кончик, чтобы создать отверстие, и под микроскопом убедитесь, что внутренний диаметр составляет от 30 до 40 мкм.

Измерьте это с помощью линейки в видоискателе. Это создаст относительно низкий импеданс от 0,3 до 0,6 МОм. Затем с неконического конца вставьте в пипетку серебряную проволоку длиной около семи сантиметров, оставив один-два сантиметра снаружи пипетки.

Отогните этот излишек проволоки перпендикулярно капилляру. Затем возьмите гиподермическую иглу калибра 30 G и нанесите гибкий пластиковый адгезив на стержень. После этого медленно вставьте иглу в пипетку.

По мере возможности добавьте больше адгезива, чтобы создать герметичное соединение в месте стыка пипетки и иглы. Оставьте сборку сохнуть примерно на 12 часов, удерживая наконечник пипетки в вертикальном положении.

После проведения анестезии и фиксации крысы в стереотаксической раме нанесите офтальмическую мазь и выбрейте шерсть на голове. После введения местного анестетика и подтверждения хирургического уровня анестезии проведите разрез кожи головы по срединной линии скальпелем с лезвием номер 10. Это позволит обнажить венечный и сагиттальный швы.

Затем с помощью хирургического шпателя определите анатомические ориентиры лямбда (Lambda) и брегма (bgma). Отрегулируйте положение головы так, чтобы эти ориентиры находились на одном горизонтальном уровне. После этого установите нулевую точку, используя тонкий жесткий указатель, например, стеклянную трубку, в области брегма (bgma).

Затем, используя координаты из bgma, переместите трубку в интересующую вас область. С помощью маркера обведите квадрат вокруг целевой зоны для проведения краниотомии. Теперь с помощью стерильного хирургического сверла медленно удалите кость вдоль отметок.

Начните с использования минимально возможного давления и постоянно перемещайте сверло, чтобы избежать повреждения тканей головки из-за трения, когда кость станет тонкой; осторожно удалите квадратный фрагмент пинцетом. Dura mater удалять не нужно, так как инъекция будет проходить сквозь неё в дальнейшем. Поддерживайте ирригацию обнаженного кортикального слоя спинномозговой жидкостью.

Подготовьте инъекционный раствор, сначала заполнив шприц объемом от 5 до 10 µL минеральным маслом. Затем приготовьте интересующий препарат с красителем в физиологическом растворе. В данном случае 0,5% Chicago sky blue смешивают с 300 µM GABA.

Теперь заполните инъекционную пипетку: сначала наберите в шприц объемом 1 мл подготовленный раствор, а затем с помощью шприца заполните пипетку. При извлечении шприца поддерживайте легкое давление на поршень, чтобы создавшийся вакуум не вытянул раствор из канала для инъекции. Проверьте возможные места утечки на предмет вытекания жидкости.

Промокните излишки жидкости и снова проверьте наличие утечек. Теперь закрепите микрошприц с минеральным маслом на направляющей для инъекций. Затем удалите остатки раствора.

С помощью марли. Проверьте наконечник для инъекций. Через него должны проходить небольшие капли раствора, в противном случае он засорен; если всё в порядке, надежно закрепите инъектор в системе микронасоса.

Затем переместите инъекционную иглу в целевые координаты и опустите электрод до верхнего двухолмия, которое можно идентифицировать путем регистрации зрительных вызванных потенциалов. При опускании электрода поддерживайте небольшое положительное давление, используя низкую скорость введения, чтобы избежать засорения. Прекратите инъекцию по достижении структуры.

После введения инъектора накройте открытую область коры теплым агаром для предотвращения высыхания. После окончательного размещения электрода подождите 30 минут, чтобы ткани вокруг электрода стабилизировались. Затем введите от 400 до 800 нанолитров раствора со скоростью 40 нанолитров в минуту до активации нейронной активности в верхнем своде; при введении ингибирующего раствора на электроде должно наблюдаться снижение частоты спайков.

Зрительные вызванные потенциалы регистрировали в верхнем двухолмии. После подачи светового импульса продолжительностью 300 миллисекунд в контрлатеральный глаз при введении GABA спайковая активность в ответ на вспышку подавлялась в течение 45–60 минут. При выполнении данной процедуры важно проверить отсутствие утечек при наборе раствора и убедиться, что раствор препарата свободно проходит через кончик инъекционной иглы.