Простой и быстрый протокол к неферментативно Диссоциируют Свежие тканей человека для анализа разведку в лимфоцитах

Общая цель этой процедуры заключается в быстрой гомогенизации фрагментов тканей человека в единую клеточную суспензию без ферментативного расщепления для качественного и количественного анализа и выделения специфических субпопуляций лимфоцитов. Это достигается путем использования стерильного скальпеля, чтобы нарезать фрагменты ткани на мелкие кусочки. Далее тканевая суспензия переносится в механическую диссоциированную трубку, где фрагменты далее гомогенизируются в одноклеточную суспензию.

Затем клетки собираются центрифугированием для последующего анализа. В конечном счете, проточная цитометрия может быть использована для анализа инфильтрирующих лимфоцитов, субпопуляций азиатов. Моя лаборатория разработала эту технику, потому что мы искали способ, с помощью которого мы могли бы визуализировать инфильтрацию опухоли в лимфоцитах без существенного влияния на их естественное состояние.

Нам нужно было что-то, где мы могли бы быстро изолировать клетки и анализировать их во время операции. Этот метод был использован на более чем 300 опухолях молочной железы и нормальных тканях в нашей лаборатории, он прост в использовании и может использоваться ежедневно. Его можно использовать для изучения прогностических маркеров, ответа на лечение и долгосрочного клинического исхода.

Демонстрировать эту технику сегодня будет Джон Никола Лоик. Техник в моей лаборатории: Начните со взвешивания образца ткани, а затем измерьте длину, ширину и высоту ткани. Затем перенесите фрагмент ткани в небольшую чашку Петри, содержащую один миллилитр подходящей, химически определенной среды свободных гемопоэтических клеток сыворотки, и с помощью стерильного скальпеля нарежьте образцы на мелкие кусочки размером от одного до двух квадратных миллиметров.

Далее переложите содержимое посуды в механическую диссоциацию С-пробирки и промойте посуду и скальпель двумя миллилитрами среды. Добавьте смывку в С-образную трубку, а затем запустите программу механической диссоциации 0,01 два раза подряд, чтобы мягко гомогенизировать фрагменты ткани в одноклеточную суспензию. После второго цикла сцедите гомогенат через ячеистый фильтр 40 микрометров в коническую пробирку объемом 50 миллилитров.

Затем используйте тот же вредитель вашей пипеткой от мытья чашки Петри, чтобы перенести любую жидкость, оставшуюся в С-трубке, в клеточное сетчатое фильтр. Затем с помощью микропипетки объемом один миллилитр переведите отфильтрованную жидкость в коническую пробирку объемом 15 миллилитров и промойте пробирку С дополнительными тремя миллилитрами среды. Перелейте эту промывку через сетчатое фильтр в 50-миллилитровую трубку.

Затем аккуратно переместите негомогенизированную ткань вокруг ситечка чистым кончиком объемом в один миллилитр, чтобы выдавить максимальное количество остаточной жидкости, попавшей в ткань, в 50-миллилитровую трубку. Теперь поместите сетчатый фильтр вверх дном поверх исходной С-трубки и промойте его еще тремя миллилитрами среды, чтобы негомогенизированная ткань упала обратно в С-трубку. Повторно гомогенизируйте ткань в течение еще двух циклов, как показано выше, а затем влейте этот второй гомогенат через клеточный фильтр.

Снова промойте С-образную трубку еще тремя миллилитрами среды. Затем отфильтруйте надосадочную жидкость через ситечко и выдавите остаточную жидкость из ткани, как показано только что на рисунке. К этому моменту в 15-миллилитровой пробирке должен присутствовать объем примерно 2,5 миллилитров одноклеточной суспензии, а в 50-миллилитровой пробирке должно наблюдаться примерно девять миллилитров.

Чтобы отделить тканевую надосадочную жидкость от клеток, сначала центрифугу, обе пробирки гомогената в течение 15 минут при 600 G и комнатной температуре, сцедить надосадочную жидкость из 15-миллилитровой пробирки в 1,5-миллилитровую пробирку, поместив ее при температуре четыре градуса Цельсия, и выбросить надосадочную жидкость из 50-миллилитровой пробирки. Затем осторожно постучите каждой трубкой по твердой поверхности, чтобы разбить каждую из гранул клетки. Повторно суспендируйте гранулу с рассыпчатыми ячейками в 50-миллилитровой пробирке с 500 микролитрами среды и перенесите клетки в 15-миллилитровую пробирку для ресуспендирования второй гранулы.

Затем промойте 50-миллилитровую пробирку еще 500 микролитрами среды и переложите промывку в 15-миллилитровую пробирку для максимального восстановления клеток. После подсчета количества жизнеспособных клеток с помощью триана синего исключения гранулы клеточной суспензии. Наконец, уменьшите остатки надосадочной жидкости.

Затем осторожно перенесите надосадочную жидкость по крайней мере в одну чистую пробирку, не касаясь и не тревожа гранулу, и храните ее при температуре минус 80 градусов Цельсия для последующего анализа. На этих графиках показаны репрезентативные точечные графики проточной цитометрии диссоциированных гомогенатов опухолевых клеток с последующим мечением специфическими антителами против лейкоцитов и маркеров эпителиальных клеток. Этот протокол существенно не изменяет жизнеспособность CD 45-положительных клеток.

Тем не менее, происходит значительная потеря жизнеспособных EPAM-положительных клеток. Несмотря на это, EPAM-положительные и CD-45-положительные субпопуляции могут быть разделены на основе их размера и структуры на крупные эпителиальные опухолевые клетки, малые эпителиальные клетки или большие и малые CD-45-положительные клетки. Здесь показаны репрезентативные точечные графики проточной цитометрии основных субпопуляций инфильтрирующих опухоль с лимфоцитами, основанными на жизнеспособности CD-45-положительных клеток.

Наконец, экспрессия цитокинов или общих иммуноглобулинов, присутствующих в надосадочной жидкости рака молочной железы, может быть сравнена с надосадочной жидкостью из нормальной ткани молочной железы, показав, как показано в этом репрезентативном эксперименте, увеличение обоих типов белков, связанных с опухолевой тканью. Анализ конечных точек.