Простой и быстрый протокол к неферментативно Диссоциируют Свежие тканей человека для анализа разведку в лимфоцитах

Общая цель данной процедуры заключается в быстром гомогенизировании фрагментов тканей человека до состояния суспензии единичных клеток без применения ферментативного расщепления для последующего качественного и количественного анализа, а также выделения специфических субпопуляций лимфоцитов. Это достигается путем предварительного измельчения фрагментов ткани на мелкие кусочки с помощью стерильного скальпеля. Затем тканевая суспензия переносится в трубку для механической диссоциации, где фрагменты подвергаются дальнейшей гомогенизации до получения суспензии единичных клеток.

Затем клетки собирают путем центрифугирования для последующего анализа. В конечном итоге для анализа инфильтрирующих лимфоцитов и их субпопуляций можно использовать проточную цитометрию. Моя лаборатория разработала этот метод, поскольку мы искали способ визуализации опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов без значительного воздействия на их естественное состояние.

Нам требовался метод, позволяющий быстро изолировать клетки и анализировать их в состоянии, соответствующем моменту проведения операции. Данная методика была применена в нашей лаборатории более чем к 300 образцам опухолей молочной железы и нормальных тканей; она проста в исполнении и может использоваться ежедневно. Ее можно применять для изучения прогностических маркеров, ответа на лечение и долгосрочных клинических исходов.

Эту методику сегодня продемонстрирует Джон Никола Лоик, лаборант моей лаборатории. Начните с взвешивания образца ткани, после чего измерьте длину, ширину и высоту ткани. Затем перенесите фрагмент ткани в маленькое чашку Петри, содержащую 1 mL подходящей химически определенной безсывороточной среды для гемопоэтических клеток, и с помощью стерильного скальпеля нарежьте образцы на мелкие кусочки размером 1–2 квадратных миллиметра.

Затем перенесите содержимое чашки в пробирку C для механической диссоциации и промойте чашку и скальпель двумя миллилитрами среды. Добавьте промывочный раствор в пробирку C, затем дважды последовательно запустите программу механической диссоциации 0.01, чтобы осторожно гомогенизировать фрагменты ткани в суспензию одиночных клеток. После второго цикла перелейте гомогенат через клеточный фильтр с размером пор 40 мкм в коническую пробирку объемом 50 миллилитров.

Затем с помощью той же пипетки, которой промывали чашку Петри, перенесите всю оставшуюся жидкость из пробирки C в сеточный фильтр для клеток. Далее с помощью микропипетки объемом 1 мл перенесите отфильтрованную жидкость в коническую пробирку объемом 15 мл и промойте пробирку C дополнительными 3 мл среды. Перенесите этот промывочный раствор через сеточный фильтр в пробирку объемом 50 мл.

Затем осторожно перемещайте не-гомогенизированную ткань по ситечку с помощью чистого наконечника объемом 1 мл, чтобы выжать максимальный объем остаточной жидкости, удерживаемой тканью, в пробирку объемом 50 мл. Теперь переверните ситечко для клеток и поместите его сверху на исходную пробирку C, после чего промойте ситечко еще тремя миллилитрами среды, чтобы не-гомогенизированная ткань переместилась обратно в пробирку C. Повторите гомогенизацию ткани еще в течение двух циклов, как было показано ранее, а затем перелейте этот второй гомогенат через ситечко для клеток.

Снова промойте пробирку С еще тремя миллилитрами среды. Затем профильтруйте супернатант через сито и выжмите остатки жидкости из ткани, как было продемонстрировано ранее. На данном этапе в пробирке объемом 15 мл должно находиться примерно 2,5 мл суспензии одиночных клеток, а в пробирке объемом 50 мл должно быть примерно девять мл.

Чтобы отделить супернатант ткани от клеток, сначала центрифугируйте обе пробирки с гомогенатом в течение 15 минут при 600 Gs и комнатной температуре, перелейте супернатант из 15-миллилитровой пробирки в 1.5-миллилитровую пробирку, поместив ее при температуре четырех градусов Цельсия, а супернатант из 50-миллилитровой пробирки удалите. Затем аккуратно постучите каждой пробиркой по твердой поверхности, чтобы разбить каждый клеточный осадок. Ресуспендируйте разрыхленный клеточный осадок в 50-миллилитровой пробирке в 500 microliters среды, после чего перенесите клетки в 15-миллилитровую пробирку для ресуспендирования второго осадка.

Затем промойте пробирку объемом 50 мл еще 500 µL среды и перенесите промывочный раствор в пробирку объемом 15 мл для максимального восстановления клеток. После подсчета количества жизнеспособных клеток методом исключения трипанового синего центрифугируйте клеточную суспензию до получения осадка. В завершение центрифугируйте сохраненный супернатант ткани.

Затем осторожно перенесите супернатант как минимум в одну чистую пробирку, не задевая и не нарушая структуру осадка, и храните его при температуре -80 °C для последующего анализа. На этих графиках представлены репрезентативные точечные диаграммы проточной цитометрии гомогенатов диссоциированных опухолевых клеток с последующим мечением специфическими антителами к лейкоцитам и маркерам эпителиальных клеток. Данный протокол не оказывает значительного влияния на жизнеспособность CD 45-положительных клеток.

Однако наблюдается значительная потеря жизнеспособных EPAM-положительных клеток. Несмотря на это, жизнеспособные EPAM-положительные и CD 45-положительные субпопуляции могут быть разделены на основе их размера и структуры на крупные эпителиальные опухолевые клетки, мелкие эпителиальные клетки, а также крупные и мелкие CD 45-положительные клетки. Здесь представлены репрезентативные точечные диаграммы проточной цитометрии основных инфильтрирующих опухоль субпопуляций, где лимфоциты отобраны по признаку жизнеспособности CD 45-положительных клеток.

Наконец, экспрессию цитокинов или общее количество иммуноглобулинов в супернатанте рака молочной железы можно сравнить с супернатантом нормальной ткани молочной железы, что, как показано в этом репрезентативном эксперименте, выявит увеличение содержания обоих типов белков, связанных с опухолевой тканью. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости работать быстро и чисто, а также извлекать максимальное количество материала на каждом этапе процедуры, чтобы получить достаточное число клеток для конечного анализа.