Комплексный анализ метилирования ДНК с использованием метода Methyl-CpG-связывающего домена для захвата у пациентов с хронической лимфоцитарной лейкемией

Общая цель данной процедуры — изучение глобального профиля метилирования и выявление дифференциально метилированных CpG-богатых регионов у пациентов с хроническим лимфоцитарным лейкозом с помощью секвенирования следующего поколения. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области эпигенетики, такие как идентификация потенциальных сигнатурных генов, специфичных для ХЛЛ, изучение патогенеза заболевания и прогнозирования. Основным преимуществом данной методики является обеспечение полного полногеномного охвата метилирования CpG объективным способом, не зависящим от ПЦР.

Для начала используйте имеющийся в продаже набор для экстракции ДНК, чтобы выделить геномную ДНК из образцов крови пациента и нормальных мононуклеарных клеток периферической крови в соответствии с протоколом производителя. После количественного определения геномной ДНК, как описано в текстовом протоколе, разведите 5 мкг геномной ДНК из каждого образца ТЕ-буфером до общего объема 200 мкл, чтобы получить конечную концентрацию 25 нг/мкл. Затем проведите соникацию в специально предназначенных для этого пробирках с помощью соникатора в течение 30 циклов (30 секунд работы и 30 секунд перерыва).

После каждых пяти циклов кратковременно центрифугируйте пробирки, чтобы осадить образцы на дно. С помощью электрофореза ДНК, как описано в текстовом протоколе, проверьте диапазон ультразвуковой обработки для всех образцов. Для подготовки магнитных стрептавидиновых бусин сначала ресуспендируйте их из стоковой пробирки, входящей в состав набора.

Осторожно перемешайте гранулы пипетированием вверх и вниз до получения гомогенной суспензии. На каждые 5 µg образца фрагментированной ДНК перенесите 50 µL гранул в отдельные чистые промаркированные пробирки объемом 1,5 мл. Добавьте 50 µL 1X буфера для промывки гранул, чтобы довести конечный объем до 100 µL.

Поместите пробирки на магнитную подставку на одну минуту, чтобы все магнитные частицы сконцентрировались на внутренней стенке пробирки, обращенной к магниту. Удалите жидкость, не затрагивая частицы, с помощью дозатора на 200 µL. Затем снимите пробирки с магнитной подставки, добавьте 250 µL 1X буфера для промывки частиц и осторожно перемешайте частицы с помощью дозатора.

После повторения этих действий как минимум четыре раза для всех образцов, в конечном итоге ресуспендируйте образцы в 250 µL 1X буфера для промывки гранул. Храните образцы на льду. Чтобы связать белок MBD-biotin с промытыми гранулами, сначала добавьте 35 µL белка в отдельные пробирки и доведите общий объем до 250 µL, используя 1X буфер для промывки гранул.

Добавьте 250 µL разведенного белка MBD к 250 µL промытых бусин и перемешивайте их в ротаторе в режиме end-to-end при комнатной температуре. После перемешивания бусин с белком в течение одного часа промойте связанные с белком магнитные стрептавидиновые бусины, поместив пробирки на магнитный штатив на одну минуту. Удалите жидкость с помощью пипетки, не касаясь бусин.

Затем добавьте 250 µL 1X буфера для промывки бусин и поместите пробирки на ротационный миксер на пять минут при комнатной температуре. Повторите этап промывки еще два раза, после чего снова суспендируйте промытые MBD-биотинилированные бусины в 200 µL 1X буфера для промывки бусин, чтобы подготовить их к захвату метилированной ДНК. В чистую 1,5-мл пробирку, не содержащую ДНКазу, добавьте 100 µL буфера для промывки бусин и 180 µL фрагментированной геномной ДНК.

Доведите конечный объем до 500 µL, используя воду, не содержащую ДНКазу. Добавьте 380 µL воды, не содержащей ДНКазу, к оставшимся 20 л фрагментированной геномной ДНК. Заморозьте образцы для последующей дальнейшей обработки и использования в качестве контрольной входной ДНК.

Поместите пробирки, содержащие промытые биотинилированные MBD-бидс, на магнитную подставку на одну минуту и удалите жидкость, не затрагивая бидс. Затем добавьте 500 µL фрагментированной геномной ДНК, разведенной в буфере для промывки бидс. Плотно закройте все пробирки парафиновой пленкой и оставьте их на ночь при температуре 4 °C на ротаторе с торцевым вращением при скорости 8–10 об/мин.

После завершения реакции связывания ДНК с магнитными частицами MBD поместите пробирки на магнитный штатив на одну минуту, чтобы собрать все частицы у внутренней стенки пробирки. Удалите супернатант пипеткой, не касаясь частиц, и сохраните эту фракцию несвязанной ДНК на льду. Затем добавьте к частицам 200 µL 1X буфера для промывки частиц и поместите пробирки на роторную стойку на три минуты при комнатной температуре.

После удаления жидкости с помощью магнитного штатива повторите промывку еще дважды, чтобы удалить остатки несвязавшейся ДНК. После финальной промывки добавьте 200 мкл высокосолевого буфера для элюции, входящего в состав набора, чтобы элюировать ДНК. Затем поместите пробирки на роторный штатив на 15 минут при комнатной температуре.

После инкубации поместите их на магнитный штатив на одну минуту и с помощью пипетки осторожно перенесите супернатант в новую чистую пробирку объемом 1,5 мл. Затем добавьте к бусинам 200 мкл буфера для элюции с высокой концентрацией соли и повторите элюцию, вращая пробирки при комнатной температуре еще в течение 15 минут. Добавьте вторую порцию элюата в ту же пробирку, в которой находятся 200 мкл первой порции элюата.

Для осаждения ДНК добавьте 1 µL гликогена, 40 µL 3 M ацетата натрия (pH 5,2) и 800 µL ледяного абсолютного этанола к 400 µL элюированной ДНК. Также добавьте реагенты к предварительно замороженным 400 µL контрольных образцов исходной ДНК. Тщательно перемешайте содержимое пробирок с помощью вортекса перед инкубацией при -80 °C в течение ночи.

На следующий день центрифугируйте пробирки при 12 000 ×g и 4 °C в течение 30 минут. Осторожно слейте супернатант, не затрагивая осадок. Затем добавьте 500 µL 70% этанола и перемешайте содержимое пробирок на вортексе.

После повторного центрифугирования пробирок при тех же условиях, но в течение 15 минут, осторожно удалите супернатант с помощью пипетки. Затем центрифугируйте пробирки на максимальной скорости в течение одной минуты при комнатной температуре и полностью удалите остатки этанола с помощью наконечника пипетки. Высушите осадок на воздухе в течение пяти минут при комнатной температуре.

Наконец, перед переходом к количественному определению метилированной ДНК, MBD-секвенированию и анализу, описанным в текстовом протоколе, добавьте 10 µL воды, не содержащей ДНКазы, к осадку ДНК. В ходе анализа было выявлено несколько дифференциально гипер- и гипометилированных регионов, обогащенных в образцах ХЛЛ по сравнению с нормальным контролем. Эти дифференциально метилированные регионы были картированы на различные классы белок-кодирующих и некодирующих генов.

Наконец, анализ данных показал значительное перекрытие между дифференциально метилированными областями, ассоциированными с ХЛЛ, которые были получены в результате двух различных сравнений с нормальным контролем. Здесь все CpG-сайты, расположенные в целевых областях двух дифференциально метилированных генов, были валидированы в большом количестве образцов ХЛЛ с помощью пиросеквенирования. Здесь проиллюстрирован оптимальный диапазон соникации, необходимый для данного метода.

Данный диапазон фрагментированной ДНК является оптимальным и наиболее подходящим для целей секвенирования следующего поколения. При правильном исполнении и наличии соответствующего опыта данная процедура может быть выполнена за два дня. При проведении этой процедуры решающими факторами, влияющими на конечный выход ДНК, являются качество и количество исходной ДНК, а также диапазон размеров фрагментированной ДНК после соникации.

Мы решили использовать этот метод, поскольку это первое глобальное исследование метилирования при ХЛЛ, основанное на иммунопреципитации для обогащения метилированной ДНК, охватывающее все метилированные области по всему геному. Значение данной методики распространяется на вопросы прогноза или терапии, так как выявленные дифференциально метилированные гены-сигнатуры могут служить глобальными нормальными биомаркерами и эпигенетическими мишенями для терапии. После выполнения данной процедуры обогащенная метилированная ДНК может быть использована для других последующих приложений, таких как гибридизация или проведение микрочипового анализа, чтобы легко сравнивать металомы двух образцов или нозологических единиц, используя фиксированный набор CpG-сайтов, представленных на чипах.

Наконец, данный метод является экономически эффективным способом анализа большого количества образцов пациентов на наличие метилированных последовательностей по всему геному, включая аннотированные последовательности, охватывающие белок-кодирующие гены, а также неаннотированные последовательности, охватывающие повторяющиеся элементы и длинные некодирующие РНК.