Комплексный анализ метилирования ДНК с использованием метода Methyl-CpG-связывающего домена для захвата у пациентов с хронической лимфоцитарной лейкемией

В этой работе описывается оптимизированный протокол секвенирования доменов с меченным CpG-связывающим доменом (MBD) и вычислительный конвейер для идентификации дифференцированных метилированных CpG-богатых областей у пациентов с хронической лимфоцитарной лейкемией (CLL).

Общей целью этой процедуры является изучение глобального профилирования метилирования и идентификация дифференциально метилированных CpG-богатых областей у пациентов с хроническим лимфоцитарным лейкозом с использованием секвенирования нового поколения. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области эпигенетики, такие как идентификация потенциальных специфичных для ХЛЛ сигнатурных генов, патогенез заболевания и прогноз. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает полный полногеномный охват метилирования CpG несмещенным и независимым от ПЦР образом.

Для начала используйте коммерчески доступный набор для экстракции ДНК для выделения геномной ДНК пациента и образцов нормальных мононуклеарных клеток периферической крови в соответствии с протоколом производителя. После количественного определения геномной ДНК, как описано в текстовом протоколе, разбавьте 5 микрограммов геномной ДНК из каждого образца, в общей сложности до 200 микролитров с использованием TE-буфера, получив конечную концентрацию 25 нанограммов на микролитр. Затем выполните ультразвуковую обработку в специально разработанных трубках с помощью ультразвуковой обработки в общей сложности 30 циклов по 30 секунд включения и 30 секунд выключения.

После каждых пяти циклов кратковременно вращайте трубки, чтобы собрать образцы на дно. Проверьте диапазон ультразвуковой обработки для всех образцов с помощью электрофореза ДНК, как описано в текстовом протоколе. Чтобы приготовить магнитные шарики стрептавидина, сначала снова подвесьте их на трубке, входящей в комплект.

Аккуратно пипетируйте шарики вверх и вниз, чтобы получить однородную суспензию. На каждые пять микрограммов фрагментированного образца ДНК поместите 50 микролитров бусин в отдельные, чистые и маркированные пробирки объемом 1,5 миллилитра. Добавьте 50 микролитров буфера для промывки шариков 1X, чтобы достичь конечного объема 100 микролитров.

Поместите трубки на магнитную подставку на одну минуту, чтобы все магнитные шарики сконцентрировались на внутренней стенке трубки, обращенной к магниту. Удалите жидкость, не касаясь шариков, с помощью пипетки объемом 200 микролитров. Затем снимите пробирки с магнитной подставки, добавьте 250 микролитров буфера для промывки шариков 1X и аккуратно перемешайте шарики с помощью пипетки.

Повторив эти шаги не менее четырех раз для всех образцов, окончательно суспендируйте образцы в 250 микролитрах буфера для промывки шариков 1X. Храните образцы на льду. Чтобы связать белок MBD-биотин с промытыми шариками, сначала добавьте 35 микролитров белка в отдельные пробирки и доведите общий объем до 250 микролитров с помощью буфера для промывки шариков 1X.

Добавьте 250 микролитров разбавленного белка MBD к 250 микролитрам промытых шариков и оставьте их на сквозном вращении при комнатной температуре. Смешав шарики с белком в течение одного часа, промойте связанные с белком магнитные шарики стрептавидина, поместив трубки на магнитную подставку на одну минуту. Удалите жидкость, не касаясь шариков, с помощью пипетки.

Затем добавьте 250 микролитров буфера для промывки шариков 1X и поместите трубки на вращающийся миксер на пять минут при комнатной температуре. Повторите этап промывки еще два раза, прежде чем повторно суспензировать промытые шарики MBD-биотина в 200 микролитрах буфера для промывки шариков 1X, чтобы шарики были готовы к захвату метилированной ДНК. В чистую пробирку объемом 1,5 миллилитра без ДНКазы добавьте 100 микролитров миллилитрового буфера для промывки гранул и 180 микролитров фрагментированной геномной ДНК.

Доведите итоговый объем до 500 микролитров, используя воду без ДНКазы. Добавьте 380 микролитров воды, не содержащей ДНКазы, к оставшимся 20 литрам фрагментированной геномной ДНК. Заморозьте образцы, чтобы позже обработать их и использовать в качестве входного контроля ДНК.

Поместите пробирки с промытыми шариками MBD-биотина на магнитную подставку на одну минуту и удалите жидкость, не потревожив бусины. Затем добавьте 500 микролитров фрагментированной геномной ДНК, разведенной в буфере для промывки шариков. Плотно запечатайте все пробирки парафиновой пленкой и оставьте их на ночь при температуре 4 градуса Цельсия на стойке встык со скоростью от 8 до 10 оборотов в минуту.

После реакции связывания шариков ДНК и MBD поместите пробирки на магнитную стойку на одну минуту, чтобы сконцентрировать все шарики на внутренней стенке пробирки. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки, не касаясь шариков, и сохраните эту несвязанную фракцию образца ДНК на льду. Затем добавьте 200 микролитров буфера для промывки шариков 1X в бусины и поместите трубки на вращающуюся подставку на три минуты при комнатной температуре.

После удаления жидкости с помощью магнитной подставки повторите промывку еще два раза, чтобы удалить остаточную несвязанную ДНК. После окончательной стирки добавьте 200 микролитров буфера для элюирования с высоким содержанием солей, входящего в комплект, чтобы элюировать ДНК. Затем поместите трубки на вращающуюся подставку на 15 минут при комнатной температуре.

После инкубации поместите их на магнитную подставку на одну минуту и с помощью пипетки осторожно перенесите надосадочную жидкость в новую, чистую пробирку объемом 1,5 миллилитра. Затем добавьте 200 микролитров буфера для элюирования с высоким содержанием соли в бусины и повторите элюирование, вращая пробирки при комнатной температуре в течение дополнительных 15 минут. Добавьте второй элют в ту же трубку, содержащую 200 микролитров первого элюта.

Чтобы осадить ДНК, добавьте один микролитр гликогена, 40 микролитров трехмолярного ацетата натрия, pH 5,2 и 800 микролитров ледяного абсолютного этанола к 400 микролитрам элюированной ДНК. Также добавьте реагенты к ранее замороженным 400 микролитрам входных контрольных образцов ДНК. Хорошо перемешайте пробирки с помощью вортекса перед инкубацией при температуре минус 80 градусов Цельсия на ночь.

На следующий день центрифугируйте пробирки при температуре 12 000 раз больше g и 4 градусах Цельсия в течение 30 минут. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость, не потревожив гранулы. Затем добавьте 500 микролитров 70% этанола и закрутите трубки.

После центрифугирования пробирок снова в тех же условиях, но в течение 15 минут, осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки. Затем центрифугируйте пробирки на максимальной скорости в течение одной минуты при комнатной температуре и полностью удалите остатки этанола с помощью наконечника для дозатора. Высушите гранулы на воздухе в течение пяти минут при комнатной температуре.

Наконец, добавьте 10 микролитров воды, не содержащей ДНКазы, в гранулу ДНК, прежде чем приступить к количественному определению метилированной ДНК, секвенированию MBD и анализу, как описано в текстовом протоколе. В ходе анализа было выявлено несколько дифференциально гипер- и гипометилированных областей, обогащенных образцами ХЛЛ по сравнению с нормальным контролем. Эти дифференциально метилированные области были картированы на различные классы кодирующих и некодирующих белков генов.

Наконец, анализ данных показал значительное перекрытие между дифференциально метилированными областями, связанными с ХЛЛ, полученными в результате двух различных сравнений нормального контроля. Здесь все сайты CpG, расположенные в целевых областях двух дифференциально метилированных генов, были валидированы в большом числе образцов ХЛЛ с помощью пиросеквенирования. Оптимальный диапазон ультразвука, необходимый для этого метода, проиллюстрирован здесь.

Этот диапазон фрагментированной ДНК идеально подходит и больше подходит для целей секвенирования следующего поколения. После освоения этой техники ее можно сделать за два дня, если она выполнена правильно. При попытке этой процедуры решающими факторами, влияющими на окончательное восстановление ДНК, являются качество и количество используемой входной ДНК, а также диапазон фрагментированной ДНК после ультразвуковой обработки.

Мы решили использовать этот метод, потому что это первое глобальное исследование метилирования ХЛЛ, основанное на иммунопреципитации для обогащения метилированной ДНК, охватывающей все метилированные участки генома. Последствия этого метода распространяются на прогноз или терапию, поскольку идентифицированные дифференциально метилированные гены сигнатур могут служить глобальными нормальными биомаркерами и эпигенетическими мишенями для терапии. После этой процедуры обогащенная метилированная ДНК может быть использована для других последующих применений, таких как гибридизация или микрочипы, чтобы легко сравнивать металомы между двумя образцами или патологическими сущностями с использованием фиксированного набора сайтов CpG, присутствующих на массивах.

Наконец, это экономически эффективный метод анализа большого количества образцов пациентов на наличие метилированных последовательностей по всему геному, включая аннотированные последовательности, охватывающие гены, кодирующие белки, а также неаннотированные последовательности, охватывающие повторяющиеся элементы и длинные некодирующие РНК.