Способ выбора Структура переключения Аптамеры Применительно к колориметрическим наночастиц золота Пробирной

Предоставляется протокол для выбора структурных переключателей для низкомолекулярных мишеней на основе метода выбора магнитных шариков с настраиваемой строгостью. Аптамеры, выбранные с свойствами переключения структуры, полезны для анализов, требующих конформационного изменения, чтобы сигнализировать о присутствии мишени, таких как описанный анализ наночастиц золота.

Общей целью данного эксперимента является генерация apti с переключением структуры для интеграции в качестве элементов распознавания на платформах обнаружения, которые функционируют, сигнализируя об изменении подтверждения аптамера при связывании с целью. Это достигается за счет добавления биотинилированного зонда захвата и дополнительной библиотеки ДНК к магнитным шарикам, покрытым стрептококком табина, для иммобилизации библиотеки ДНК на поверхности бусины. Затем к раствору прикладывают магнит, чтобы отделить связующие последовательности от несвязываемых последовательностей, оставшихся на бусинах.

Затем сохраненные последовательности очищаются и амплифицируются для следующего раунда отбора. После нескольких раундов отбора в процесс добавляется отрицательный шаг отбора. После нескольких раундов отбора выбранный aptr демонстрирует структурное изменение при связывании мишени на основе анализа обнаружения мишени на основе наночастиц золота.

Преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как клетка X на основе раствора, заключается в том, что нам не нужно иммобилизовать мишень до твердой опоры. Таким образом, последствия этого метода заключаются в оценке риска физиологического состояния человека, и это связано с тем, что кортизол является индикатором стресса, что может привести к оценке проблем со здоровьем. Всегда используйте свежеприготовленные растворы ДНК для этого протокола, особенно для мишени и контроля.

Подготовка ДНК требует особого внимания. Переложите 100 микролитров аликвоты библиотеки ДНК в термоамплификатор и нагрейте его при температуре 95 градусов Цельсия в течение пяти минут в термомиксере. Затем перенесите трубку в лед до тех пор, пока она не понадобится, перед использованием этой ДНК определите ее точную концентрацию на спектрофотометре.

Далее подготовьте магнитные шарики, закодированные магнитные шарики и переложите 400 микролитров из них в новую микроцентрифужную пробирку. Поместите эту трубку на магнит на две минуты и удалите надосадочную жидкость, после чего промойте бусины. Добавьте 400 микролитров связующего буфера и перебейте их в вихрь до завершения стирки.

С помощью магнита отделите шарики и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите этот процесс стирки три раза. Далее обездвижите щуп захвата на магнитных шариках.

Начните с суспензии гранул и 400 микролитров связующего буфера с помощью 50 микромолярного зонда захвата. Затем выдержите бусины в течение 10 минут при слабом перемешивании при комнатной температуре. Чтобы извлечь свободный щуп захвата, промойте бусины еще три раза, как и раньше, используя 400 микролитров связующего буфера на одну промывку.

После трех стирок добавьте еще 400 микролитров буфера и соберите 100 микролитров раствора для оставшихся этапов, сохраняя остаток при четырех градусах Цельсия. Оставшаяся часть может быть использована для последующих раундов отбора на срок до трех недель. Когда требуется больше бусин, их можно подготовить с помощью более длинных щупов для повышения строгости в этой схеме отбора.

Например, после 13-го раунда использовались более длинные зонды, после чего было достигнуто значительное обогащение за счет других строгих условий. При использовании бусин, взятых из хранилища, начните с двукратной промывки рабочей аликвоты, используя 200 микролитров связующего буфера на одну стирку. В противном случае свежеприготовленные бусины уже чистые.

Теперь добавьте 100 микролитров ДНК Snap cool к бусинам и инкубируйте их в течение получаса при комнатной температуре при слабом перемешивании. После инкубации изолируйте бусины, прежде чем выбрасывать надосадочную жидкость. Вычислите концентрацию содержащейся в ДНК ДНК, чтобы определить, сколько ДНК связано с бусинами.

Далее трижды промойте бусины 200 микролитрами связующего буфера. Дайте переплетному буферу промыть бусины с легким помешиванием в течение пяти минут каждый раз. Затем приготовьте молекулу-мишень в буфере для связывания на 100 микромоль и ресуспендируйте гранулы в 200 микролитрах этого препарата, молекулы-мишени.

В этом случае кортизол, как правило, имеет высокую концентрацию в первом раунде отбора. Высиживайте бусины с мишенью в течение получаса при осторожном перемешивании при температуре окружающей среды. После инкубации сохраните снат, содержащий целевые упомянутые последовательности.

После каждого второго раунда обогащения отбирайте пробу из конечной надосадочной жидкости, чтобы контролировать процесс для мониторинга. Удалите кортизол из надосадочной жидкости с помощью диализа. Это можно пропустить, если молекула-мишень не мешает измерению поглощения ДНК на 260 нанометрах после каждого раунда, амплифицировать связывающую ДНК-мишень методом ПЦР, используя в качестве матрицы собранную надосадочную жидкость на этапе положительного отбора.

Предварительно всегда проводят небольшую тестовую ПЦР для определения оптимального количества амплификаций. Отбирайте 10 микролитровых проб после каждого цикла и сравнивайте образцы с лестницей из 25 пар оснований. Здесь библиотека должна работать на 85 парах оснований над усиленными произведениями, видимыми после 10-го цикла, поэтому следует использовать меньше циклов.

Этот результат может варьироваться от раунда к раунду, поэтому всегда необходим тестовый прогон. Затем проведите крупномасштабную ПЦР с использованием выбранного количества циклов с использованием восьми полосковых пробирок. Амплифицируйте от шести до восьми миллилитров реакционной смеси, чтобы получить необходимое количество ампликона для следующего раунда отбора, которое составляет от одного до 2,5 наномолей ДНК.

Перепроверьте образец ПЦР-продуктов с помощью геля. Затем преобразуйте основную массу продуктов в одноцепочечную ДНК с помощью немагнитных стрептированных покрытых шариков. Загрузите 300 микролитров бусин в небольшую колонку, заблокированную фрицем.

Затем с помощью шприца с замком приманки аккуратно промойте бусины пятью миллилитрами связующего буфера. При смене раствора для промывки колонки извлеките шприц из колонки и извлеките поршень из шприца. Это предотвращает ненужное беспокойство бусин.

Создать и промыть достаточное количество валиковых столбиков по одному миллилитру ПЦР-продукта на одну колонку. Пропустите ПЦР-продукт через колонны под слабым давлением. Продукты ДНК будут удерживаться бусинами, прикрепленными их антисмысловыми нитями.

Затем промойте связанные с ДНК колонки пятью миллилитрами связывающего буфера, чтобы удалить все компоненты ПЦР, оставив только пул связывания ДНК для дегибридизации ДНК, из колонки добавьте 0,5 миллилитра 0,2 моляра гидроксида натрия. Затем обессолите одноцепочечную ДНК в ЭИТ с помощью обессоливающей колонки, приготовленной из воды, не содержащей нуклеаз. Отбросьте первоначальные 0,5 миллилитра проточного потока.

Затем пропустите один миллилитр воды, свободной от нуклеазы, через колонку, чтобы собрать обессоленную ДНК. Измерьте поглощение собранной ДНК и подготовьте ее к следующему раунду отбора. Как описано в текстовом протоколе, собранная одноцепочечная ДНК теперь добавляется обратно к свежеприготовленной аликвоте из бусин, приготовленной с помощью зонда захвата.

Второй раунд отбора аналогичен первому с более низкой концентрацией кортизола. Однако, начиная с третьего раунда, включите отрицательный шаг отбора перед положительным выбором. Для первого раунда отрицательного отбора добавьте 200 микролитров одного микромолярного прогестерона в связывающем буфере к шарикам.

Он структурно похож, но отличается от кортизола. В последующих раундах увеличивайте концентрацию прогестерона после аккуратного встряхивания смеси в течение получаса при комнатной температуре. Выбросьте супинат и промойте бусины два раза, используя 200 микролитров связующего буфера.

Затем приступаем к положительному отбору. Как уже говорилось ранее, по мере прохождения раундов концентрация субстрата варьировалась, что влияло на строгость процесса отбора. Детали обсуждаются в текстовом протоколе.

Затем следуйте текстовому протоколу, чтобы выполнить анализ наночастиц золота для обнаружения кортизола. Это быстрое и простое считывание цветовой метрики основано на структурном изменении аптамера при связывании с мишенью. Таким образом, он предоставляет метрику для оценки способности метода выбирать аберы со свойствами переключения структуры.

Еще одно преимущество анализа наночастиц золота заключается в том, что он усиливает сигнал таким образом, что микромолярный аффинный аптамер, общий для малых молекул, может быть обнаружен на уровнях, на порядки ниже константы диссоциации. Для выделения аберов, специфичных для кортизола, использовался следующий протокол отбора. Диализ и мониторинг обогащения были использованы, чтобы показать повышенное элюирование молекулы-мишени после более поздних этапов отбора.

Снижение элюирования наблюдалось при использовании меньшего количества молекул-мишени и более длинных зондов захвата на заключительных этапах. Секвенирование нового поколения было использовано для анализа ускользающей ДНК после нескольких различных раундов. В начале шестого раунда отбора низкий процент последовательностей имел увеличенное количество копий, которое было ранжировано в 20 ячеек после 13 раундов.

Гораздо больший процент аберов был в большом количестве копий. Затем, сделав процесс отбора более строгим. В раундах 14 и 15 почти половина отобранных аберов находилась в первом ранге частоты числа копий.

На тот момент было около 3000 уникальных последовательностей в 30 000 прогонов. Выбранный АП инкубировали с наночастицами золота с последующим добавлением мишени или для сравнения контрольных подложек. Этот анализ показал, что АП обладает большей специфичностью к кортизолу, чем к колиевой кислоте или к При попытке проведения этой процедуры.

Важно контролировать строгость отбора в каждом раунде, а также оптимизировать количество циклов ПЦР. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выбрать АР с переключением структуры и провести анализ на обнаружение наночастиц золота.