Быстрое и количественный Флуориметрический Метод белка-таргетинга маленькая молекула наркотиками Скрининг

Общая цель этого нового флуорометрического метода скрининга лекарств заключается в определении аффинности связывания малых молекул лекарства с белком-мишенью путем формирования флуоресцентных золотых нанокластеров в матрице белка, загруженного лекарством. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нацеливания на белки и открытия лекарств, например, как видимая сила молекул лекарств может повлиять на стабильность белков от развертывания, что приводит к образованию флуоресцентных золотых нанокластеров различной интенсивности. Основное преимущество этого метода заключается в том, что мы можем превратить белковую мишень в флуоресцентный биосенсор, чтобы обеспечить быстрый скрининг низкомолекулярных препаратов без необходимости использования сложных инструментов и утомительных этапов маркировки.

Сочетание моих собственных знаний, а также соавтора, ее открытия в виде загруженного белка, оказывает отчетливое стабилизирующее действие на плазмону. Наночастицы вдохновили на идею этого метода. Начните эту процедуру с подготовки химических реагентов для скрининга лекарственных средств, как подробно описано в текстовом протоколе для приготовления альфамина сыворотки крови человека или шаблонных золотых нанокластеров HSA, поместите два стеклянных флакона, каждый из которых содержит микромагнитную полосу для перемешивания, на двух отдельных магнитных мешалках с регулируемой температурой.

Установите температуру одного магнитного перемешивания на 60 градусов Цельсия. Затем добавьте 200 микролитров раствора сывороточного альбумина человека, 200 микролитров сверхчистой воды и 200 микролитров раствора хлорида золота в каждый флакон при постоянном помешивании, чтобы обеспечить инкапсуляцию ионов золота внутри белковой матрицы, через две минуты добавьте 20 микролитров раствора гидроксида натрия в каждый флакон, чтобы активировать восстановительную способность сывороточного альбумина человека, информирующего нанокластеры золота. Начните записывать время реакции в ноль минут каждые 20 минут.

Наберите по 50 микролитров каждого образца и переложите в черную пластину на 384 лунки. Измерьте спектр излучения с помощью считывателя микропланшетов. Прекратите магнитное перемешивание через 100 минут.

Охладите стеклянные флаконы под проточной водой в раковине. Стройте графики спектров фотоизлучения в любое время для каждого образца, чтобы получить кинетику формирования нанокластеров золота при различных температурных условиях. Чтобы приготовить бычий сывороточный альбумин или нанокластеры золота с шаблоном BSA, поместите стеклянный флакон, содержащий микромагнитную мешалку, на верхнюю часть магнитной мешалки.

Оставьте температуру как комнатную. Смешайте в стеклянном флаконе 200 микролитров раствора БСА, 200 микролитров мочевины и 200 микролитров раствора хлорида золота при постоянном помешивании. Через две минуты на 20 микролитров раствор гидроксида натрия.

Активировать восстановительную способность BSA образовывать нанокластеры золота и начать записывать время реакции как ноль минут. Измеряйте спектр фотоизлучения реакционной смеси каждый час. Поместите пять стеклянных флаконов, каждый из которых содержит магнитную мешалку и предварительно помечен препаратом или чистым HSA, поверх многоточечной магнитной мешалки с регулируемой температурой.

Добавьте 200 микролитров HSA в каждый флакон. Затем добавьте по одному микролитру каждого ранее приготовленного раствора препарата в четыре соответствующие файлы. Также добавьте один микролитр ДМСО в переключатель управления на размешивателе

Установите скорость отжима на 360 об/мин и инкубируйте в течение одного часа, чтобы дать возможность лекарству соединиться с HSA через час при концентрации 200 микролитров воды milli Q и 200 микролитров раствора хлорида золота в каждом флаконе при постоянном перемешивании. Установите температуру 60 градусов Цельсия при постоянном помешивании в течение 10 минут. Через 10 минут по 20 микролитров 1,5 моляра гидроксида натрия в каждый файл и начать записывать время реакции в ноль минут.

Совместные реакции растворов для измерения должны проходить в той же последовательности добавления препаратов и должны практиковаться как можно быстрее, чтобы свести к минимуму эффект временного запаздывания Быстро набирать по 50 микролитров раствора из каждого флакона. Перенесите на черную пластину на 384 лунки и измерьте спектр излучения. Записывайте спектры излучения каждого образца каждые 10 минут, собирая не менее четырех спектров в четыре разных момента.

Повторите эти шаги несколько раз, чтобы получить результаты с устойчивой тенденцией. Построение графика спектров фотоизлучения с временным разрешением для каждого образца. Определите пиковую интенсивность всех образцов и сопоставьте график с течением времени для сравнения кинетики образования нанокластеров золота в различных белковых матрицах, загруженных лекарствами, чтобы измерить константу связывания между каждым препаратом и HSA.

Замените растворы препарата растворами ибупрофена в четырех разных концентрациях. Через 10 минут охладите стеклянные флаконы под проточной водой в раковине. Наберите по 50 микролитров вышеуказанных растворов из каждого флакона в черную пластину на 384 лунки и измерьте спектр излучения.

Повторите эти шаги еще дважды, чтобы получить еще два набора результатов при разных концентрациях препарата, прежде чем прекратить магнитное перемешивание. Затем строятся фотоэмиссионные спектры и анализируются полученные результаты для исходных материалов в каждой отдельной партии. Построите график спектров фотоизлучения каждого образца в программном обеспечении, таком как Origin Pro, и определите пиковую интенсивность.

Рассчитайте и нанесите график зависимости относительной интенсивности флуоресценции от концентрации препарата. Затем рассчитайте константу привязки, подогнав данные к модели привязки одного сайта. Использование уравнения цемента Mics для этого в программном обеспечении, таком как Origin Pro.

Выберите в меню «Анализ подгонки нелинейной кривой», затем выберите функцию града из категории сигмоидальных линий роста на странице выбора функции настроек. Нажмите по размеру, чтобы отобразить. Показанные здесь результаты являются репрезентативными результатами фотоэмиссионных спектров нанокластеров золота с временным разрешением, полученных при различных условиях денатурации белков.

Это можно наблюдать на золоте: нанокластеры формируются быстрее при более высокой температуре. Денатурирующее состояние мочевины также может способствовать прямому синтезу нанокластеров золота с использованием белка BSA в качестве матрицы. Здесь представлены типичные результаты быстрого флуорометрического скрининга лекарственных препаратов на основе интенсивности флуоресценции нанокластеров золота с использованием HSA с лекарственным сырьем в качестве шаблона.

Чем выше интенсивность флуоресценции, тем слабее прочность связывания молекулы лекарственного препарата с HSA. Эти спектры показывают влияние концентрации лекарственной нагрузки на скорость образования флуоресцентных нанокластеров золота внутри ГСА, загруженного ибупрофеном. Чем выше концентрация препарата, тем ниже флуоресцентный сигнал полученных нанокластеров золота, показанных здесь, является репрезентативным результатом определения константы связывания белка с лекарством.

Он рассчитывается путем подгонки относительной интенсивности флуоресценции нанокластеров золота, синтезированных в матрице HSA, предварительно загруженной ибупрофеном в различных концентрациях, с использованием уравнения цементина MICU. После освоения этот метод может быть выполнен за 30 минут для параллельного множественного скрининга лекарств, если он выполнен правильно. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как синтезировать рейн, создать нанокластер в белке, загруженном лекарством, и определить аффинность связывания лекарств с белком-мишенью, что можно обнаружить по флуоресцентному сигналу, излучаемому полученными золотыми нанокластерами.