Быстрое и количественный Флуориметрический Метод белка-таргетинга маленькая молекула наркотиками Скрининг

Общая цель этого нового флуорометрического метода скрининга лекарственных средств заключается в определении аффинности связывания малых молекул лекарств с белком-мишенью путем формирования флуоресцентных золотых нанокластеров внутри шаблона белка, нагруженного лекарственным средством. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области поиска лекарств, нацеленных на белки, например, как сила связывания молекул лекарства может влиять на стабильность белков, предотвращая их разворачивание, что ведет к образованию флуоресцентных золотых нанокластеров различной интенсивности. Основное преимущество данной методики заключается в том, что мы можем превратить белок-мишень в флуоресцентный биосенсор, что позволяет проводить быстрый скрининг низкомолекулярных лекарственных препаратов без необходимости использования сложного оборудования и проведения трудоемких этапов маркировки.

Сочетание моих собственных знаний с открытиями моего соавтора показало, что загрузка белка оказывает выраженный стабилизирующий эффект на плазмонные наночастицы, что и легло в основу данного метода. Начните выполнение этой процедуры с подготовки химических реагентов для скрининга лекарственных средств, как подробно описано в текстовом протоколе; для приготовления золотых нанокластеров на основе человеческого сывороточного альбумина (HSA) поместите две стеклянные виалы, в каждой из которых находится микромагнитная мешалка, на две отдельные магнитные мешалки с контролем температуры.

Установите температуру одного магнитного перемешивателя на 60 °C. Затем при постоянном перемешивании добавьте в каждый флакон 200 µL раствора человеческого сывороточного альбумина, 200 µL ультрачистой воды и 200 µL раствора хлорида золота для инкапсуляции ионов золота внутри белкового шаблона. Через две минуты добавьте в каждый флакон 20 µL раствора гидроксида натрия, чтобы активировать восстановительную способность человеческого сывороточного альбумина для формирования нанокластеров золота. Начните отсчет времени реакции с нулевой минуты, проводя замеры каждые 20 минут.

Отоберите по 50 µL каждого образца и перенесите их в черный 384-луночный планшет. Измерьте спектр эмиссии с помощью планшетного ридера. Остановите магнитное перемешивание через 100 минут.

Охладите стеклянные флаконы под проточной водой в раковине. Постоянно регистрируйте спектры фотоэмиссии для каждого образца, чтобы определить кинетику образования нанокластеров золота при различных температурных условиях. Для приготовления нанокластеров золота на матрице бычьего сывороточного альбумина (BSA) поместите стеклянный флакон с микромагнитным перемешивателем на магнитную мешалку.

Оставьте температуру на уровне комнатной. При постоянном перемешивании смешайте в стеклянном флаконе 200 µL раствора BSA, 200 µL мочевины и 200 µL раствора хлорида золота. Через две минуты добавьте 20 µL раствора гидроксида натрия.

Для активации восстановительной способности BSA с целью формирования золотых нанокластеров начните отсчет времени реакции с нулевой минуты. Каждый час измеряйте спектр фотоэмиссии реакционной смеси. Поместите пять стеклянных флаконов, в каждом из которых находится магнитный перемешиватель и имеется предварительная маркировка с названием препарата или чистой HSA, на многопозиционную магнитную мешалку с регулируемой температурой.

Добавьте 200 µL HSA в каждый флакон. Затем добавьте по одному µL каждого из ранее приготовленных растворов лекарственных средств в четыре соответствующих флакона. Также добавьте один µL DMSO в контрольный образец на перемешивателе.

Установите скорость вращения на 360 RPM и инкубируйте в течение одного часа, чтобы обеспечить связывание препарата с HSA; спустя час добавьте в каждый флакон 200 µL воды Milli-Q и 200 µL раствора хлорида золота при постоянном перемешивании. Установите температуру 60 °C при постоянном перемешивании на 10 минут. Через 10 минут добавьте в каждый флакон 20 µL 1.5 M гидроксида натрия и начните отсчет времени реакции с нулевой минуты.

Для проведения измерений совместные реакционные растворы должны быть подготовлены в строго определенной последовательности добавления препаратов; процедуру следует выполнять максимально быстро, чтобы минимизировать эффект временной задержки. Быстро перенесите по 50 µL раствора из каждого флакона. Передайте их в черный 384-луночный планшет и измерьте спектр эмиссии. Регистрируйте спектры эмиссии каждого образца каждые 10 минут, собрав не менее четырех спектров в четыре разных момента времени.

Повторите эти шаги несколько раз, чтобы получить результаты с устойчивой тенденцией. Постройте спектры фотоэмиссии с временным разрешением для каждого образца. Определите пиковую интенсивность для всех образцов и постройте график зависимости интенсивности от времени, чтобы сравнить кинетику формирования золотых нанокластеров в различных белковых матрицах, нагруженных лекарственными препаратами, и измерить константу связывания между каждым препаратом и HSA.

Замените растворы препаратов растворами ибупрофена четырех различных концентраций. Через 10 минут охладите стеклянные флаконы под проточной водой в раковине. Перенесите по 50 µL полученных растворов из каждого флакона в черный 384-луночный планшет и измерьте спектр эмиссии.

Повторите эти шаги еще дважды, чтобы получить еще два набора результатов при разных концентрациях препарата, после чего остановите магнитную мешалку. Затем постройте спектры фотоэмиссии и проанализируйте результаты для необработанных данных, полученных в каждой отдельной партии. Постройте спектры фотоэмиссии каждого образца в таком программном обеспечении, как Origin Pro, и определите интенсивность пика.

Рассчитайте и постройте график зависимости относительной интенсивности флуоресценции от концентрации препарата. Затем рассчитайте константу связывания, подходя данные под модель связывания с одним центром. Для этого используйте уравнение Михаэлиса-Ментен в таком программном обеспечении, как Origin Pro.

Выберите в меню пункт анализ (analysis), затем «аппроксимация нелинейной кривой» (non-linear curve fit), после чего на странице выбора функции в настройках выберите функцию Хилла (hill function) из категории сигмоидального роста (growth sigmoidal). Нажмите «аппроксимировать» (fit) для отображения. Представленные здесь результаты аппроксимации являются репрезентативными данными спектров фотоэмиссии с временным разрешением для нанокластеров золота, полученных при различных условиях денатурации белков.

Можно заметить, что нанокластеры золота образуются быстрее при более высокой температуре. Условия денатурации мочевиной также могут способствовать прямому синтезу нанокластерных золота с использованием белка BSA в качестве шаблона. Здесь представлены типичные результаты экспресс-флуориметрического скрининга лекарственных средств, основанного на интенсивности флуоресценции нанокластеров золота с использованием HSA, нагруженного лекарственным препаратом, в качестве шаблона.

Чем выше интенсивность флуоресценции, тем слабее сила связывания молекулы лекарственного вещества с HSA. На этих спектрах показано влияние концентрации загруженного препарата на скорость образования флуоресцентных золотых нанокластеров внутри HSA, нагруженного ибупрофеном. Чем выше концентрация препарата, тем ниже флуоресцентный сигнал полученных золотых нанокластеров; здесь представлен типичный результат определения константы связывания белка с лекарственным веществом.

Расчет производится путем аппроксимации относительной интенсивности флуоресценции золотых нанокластеров, синтезированных в матрице HSA, предварительно нагруженной ибупрофеном в различных концентрациях, с использованием уравнения Сейментина MICUs. При должном навыке и правильном исполнении данная методика позволяет провести параллельный скрининг нескольких препаратов за 30 минут. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать процесс синтеза золотых нанокластеров в нагруженном препаратом белке, а также способ определения аффинности связывания препаратов с белком-мишенью по флуоресцентному сигналу, излучаемому полученными золотыми нанокластерами.