Следующее поколение Секвенирование для обнаружения осуществимых Мутации в твердых и жидких опухолей

Общей целью этого целевого ампликон-анализа секвенирования нового поколения является обнаружение патогенных мутаций в опухолях пациентов для терапевтического использования, включая диагностику, прогностическое и ответ на таргетную терапию. Этот метод дает ответы на ключевые вопросы, например, есть ли у пациента мутация в гене, который может выиграть от таргетной или альтернативной терапии. Основное преимущество этого метода заключается в том, что действенные мутации, как обычные, так и редкие, во многих генах могут быть обнаружены в любой опухолевой ткани с помощью одного анализа.

Поскольку техники и технологии настолько сложны, а шаги так сложны для изучения, крайне важно продемонстрировать этот метод визуально. Это определяющий момент в развитии медицинской онкологии. С внедрением в клинику секвенирования нового поколения у нас будет больше и более качественных методов лечения рака для наших пациентов.

Наши технологи CPD Барент Ли, Патрик Кандреа, Картик Ганапати и Джо Грабб продемонстрируют эту процедуру. Я также помогу в этом процессе, чтобы показать более сложные части анализа. После извлечения геномной ДНК по текстовому протоколу, следуя протоколу производителя, пропустите два микролитра извлеченной ДНК на флуориметре для получения рабочей концентрации образца.

Чтобы создать библиотеку ампликонов, в полуизогнутую 96-луночную пластину, называемую Hyb Plate, добавьте необходимый объем низкого ЭДТА TE, пять микролитров олиго-трубки панели, добавьте от 100 до 250 нанограммов геномной ДНК в каждую соответствующую лунку. Это самый важный шаг, так как любая путаница здесь будет иметь серьезные последствия. После добавления олигогибридизации для секвенирования реагента 1 и вращения в соответствии с текстовым протоколом инкубируйте планшет Hyb в предварительно нагретом гибридизационном инкубаторе при температуре 95 градусов Цельсия в течение одной минуты.

После медленного охлаждения инкубатора до 40 градусов Цельсия извлеките пластину из инкубатора, и перенесите весь объем каждого образца из Hyb Plate в центр предварительно подготовленного соответствующего, предварительно промытого блока фильтровальной пластины, или FPU. Накройте крышкой FPU и центрифугируйте при температуре 2, 250 G и 20 градусах Цельсия в течение трех минут. Затем добавьте 45 микролитров SW1 и снова центрифугируйте.

После второй промывки с помощью SW1 и промывки с помощью UB1 добавьте 45 микролитров смеси для лигирования Extension Ligation Mix 3 в каждую лунку и трижды перемешайте. Используйте клейкую алюминиевую фольгу для герметизации пластины и инкубируйте всю сборку FPU в предварительно нагретом до 37 градусов Цельсия инкубаторе в течение 45 минут. Чтобы проиндексировать ПЦР-амплификацию, расположите праймеры в пластине для индексной амплификации или приспособлении IAP и поместите используемые индексы в соответствующие лунки в пластине, затем добавьте 22 микролитра PCR Master Mix, 2E12, и проведите его вверх и вниз три раза.

Затем, после 45-минутной реакции лигирования в соответствии с текстовым протоколом, добавьте 25 микролитров 50 миллимолярного гидроксида натрия в каждую лунку для образца FPU и прокачайте его вверх и вниз не менее шести раз, следя за тем, чтобы наконечник пипетки соприкасался с мембраной. Затем, слегка наклонив планшет и установив многоканальную пипетку на 20 микролитров, пипетируйте гидроксид натрия в планшете FPU вверх и вниз не менее шести раз. Перенесите элюирование из FPU в соответствующую колонку IAP.

Осторожно проводите пипеткой вверх и вниз, чтобы полностью объединить ДНК с PCR Master Mix, прежде чем запускать программу ПЦР, описанную в текстовом протоколе. После проверки выхода библиотеки и инкубации образцов с бусинами магнитной очистки в соответствии с текстовым протоколом, добавьте 30 микролитров EBT в каждую лунку промытых бусин. Сделайте пипетку вверх и вниз несколько раз, чтобы убедиться, что шарики оторвались от боковой стороны трубки.

После того, как планшет был инкубирован с встряхиванием, а затем без него, поместите планшет на магнитную подставку и перенесите 20 микролитров надосадочной жидкости на совершенно новую пластину, называемую Библиотечной Нормализационной Пластиной, или LNP. После приготовления нормализующей смеси, с прерывистой инверсией и вихревым движением раствора, добавьте 45 микролитров в каждый образец ЛНП. Затем используйте прозрачную клейкую пленку, чтобы запечатать пластину, и встряхивайте со скоростью 1 800 об/мин в течение 30 минут.

После промывки бусин снимите ЛНП с магнитной подставки и для элюирования образца добавьте в каждую лунку по 30 микролитров свежего 0,1 нормального гидроксида натрия. Затем встряхивайте LNP при 1 800 RMP в течение пяти минут. Поместите LNP обратно на магнитную подставку и после того, как надосадочная жидкость очистится, перенесите 30 микролитров элюирования в заранее подготовленный буфер 1 для нормализации библиотеки в планшете для хранения.

Наклоните планшет вниз, затем добавьте пять микролитров каждого образца для секвенирования в помеченную Pooled Amplicon Library (PAL) 1,5-миллилитровую пробирку. В зависимости от того, какая химия секвенирования используется, добавьте от четырех до 10 микролитров PAL к 590-596 микролитрам буфера HT1. Очистите и загрузите проточную ячейку.

Загрузите реагенты. Следуйте инструкциям на экране, чтобы начать выполнение секвенирования. После завершения сеанса секвенирования выполните конвейер биоинфоматики.

Проанализируйте статистику выполнения, чтобы убедиться, что секвенированная библиотека прошла определенные в лаборатории метрики контроля качества. Наконец, в средстве просмотра геномных данных вручную просмотрите каждый вариант, просмотрев файлы BAM. Это краткое изложение наиболее важных статистических данных о прогоне, не включая среднее покрытие, используемое для определения того, прошла ли выборка подготовки библиотеки QC.As показано здесь Для первого случая биоинформатика обнаружила четыре мутации, связанные с ОМЛ, о которых можно сообщить.

Миссенс-мутация в FLT3, миссенс-мутация в IDH2 и мутация со сдвигом рамки считывания в NPM1. Мутации в FLT3 наблюдаются примерно у 25% взрослых пациентов с ОМЛ. Прогностическое значение мутаций киназы FLT3, наблюдаемых у этого пациента с ОМЛ, оказывает неясное влияние на прогноз.

Изоцитратдегидрогеназа 2, или IDH2, кодирует эпигенетический модификатор, который обычно мутирует при ОМЛ. Мутации в гене нуклеофосмина, или NPM1, являются одними из наиболее часто приобретаемых мутаций при ОМЛ. В этой таблице перечислены все экзонические варианты для второго случая.

Были обнаружены две мутации, связанные с заболеванием. Вставка в кадр в экзон 20 ERBB2 и миссенс-мутация в TP53. HER2/neu, или ERBB2, кодирует рецептор тирозинкиназы.

Активация инсерций HER2/neu экзона 20 наблюдается в 2-4% случаев аденокарциномы легких и составляет большинство мутаций HER2/neu, наблюдаемых при раке легкого. Изменения TP53 также часто встречаются при раке. Необходимо обратить пристальное внимание на качество и количество извлекаемой ДНК.

Это особенно важно для образцов FFPE. Мы часто пытаемся сильно деградировать с переменной выходом ДНК. В процессе валидации клинического анализа должны быть установлены показатели качества и количества ДНК для каждого образца, прежде чем ДНК будет передана в библиотечную подготовку.

В дополнение к подготовке библиотеки, крайне важно проверить биоинфоматический план шпионажа, определив пороговые значения для прогона секвенирования, статистику контроля качества, статистику подготовки библиотеки, глубину смелости ампликона и минимальную частоту сообщаемого аллеля. После освоения подготовка библиотеки может быть выполнена в течение рабочего дня. Но общий рабочий процесс анализа требует больше времени для извлечения ДНК, секвенирования, обработки данных и анализа вариантов.

Эта процедура предназначена для изучения только геномных мутаций ДНК в определенных ключевых горячих точках. Другие массы, использующие РНК, могут быть выполнены для ответа на дополнительные вопросы, такие как дифференциальная экспрессия генов, связь с опухолями риска и структурные перестройки. На горизонте уже видны крупные достижения.

Внедрение автоматизации и внедрение уникального молекулярного штрихкодирования позволит лабораториям сократить время обработки, использовать меньше входных образцов и обнаруживать варианты с очень низкой частотой аллелей. Обнаружение мутаций, связанных с заболеванием, в образцах рака является стандартом лечения на протяжении десятилетий. NGS — это менее предвзятый подход к секвенированию нескольких генов, связанных со многими видами рака, параллельно, что приводит к выявлению множественных мутаций и улучшению лечения пациентов.

Спасибо за просмотр, и удачи в ваших экспериментах.