Интеграция мокрого и сухого Bench Оптимизирует Targeted Следующее поколение Секвенирование низкого качества и низкого количества Опухолевые Биопсию

Общая цель этой процедуры — описать комплексную систему для секвенирования сложных образцов рака, которая сочетает в себе влажные лабораторные реагенты, стандартизированные средства контроля и стендовый набор биоинформатики. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области рака, такие как секвенирование биопсии опухоли низкого качества и низкого качества для достижения точного анализа и интерпретации вариантов ДНК. Основное преимущество этого метода заключается в том, что образцы, которые трудно секвенировать, — это те, которые просто имеют ограниченное количество доступной ДНК, могут быть быстро и надежно проанализированы с использованием реагентов и элементов управления из одного источника, а также полностью интегрированного программного обеспечения для биоинформатики.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности из-за сложности целевого NGS, который этот метод упрощает. Тем не менее, процедуры количественной оценки библиотек и объединения образцов требуют особого внимания для достижения равномерного охвата во всех библиотеках образцов. Этот протокол объединяет процессы мокрого и сухого стенда для секвенирования сложных образцов рака.

Первым шагом является количественная оценка и квалификация ДНК для определения количества матричных копий ДНК, которые могут быть амплифицированы с помощью ПЦР в реальном времени. Начните процедуру количественного определения образцов и контроля качества с подготовки достаточного количества исходной смеси в микроцентрифужной пробирке. Используйте следующие объемы на образец: 5 микролитров 2x мастер-смеси, 0,5 микролитра смеси праймер-зондов, 0,5 микролитра смеси грунтовочных зондов, 0,05 микролитра ROX и 2,95 микролитра разбавителя.

Добавьте девять микролитров мастер-смеси в каждую лунку 96-луночной пластины. Добавьте один микролитр стандартов ДНК в двух экземплярах и перемешайте, пипетируя вверх и вниз пять раз. Убедившись, что образец нуклеиновой кислоты хорошо перемешан, добавьте один микролитр образца в исходную смесь и перемешайте, пипетируя вверх и вниз пять раз.

Поместите запечатанную пластину в систему ПЦР. Выполните циклы ПЦР продолжительностью 10 минут при 95 градусах Цельсия, затем 40 циклов по 15 секунд при 95 градусах Цельсия и одну минуту при 60 градусах Цельсия. Проанализируйте данные количественной ПЦР, построив график линейной регрессии для каждого из дубликатов стандартов ДНК.

Затем рассчитывается концентрация неизвестной ДНК в функциональном или амплифицируемом числе копий на микролитр, как описано в тексте протокола. Следующим шагом после количественного определения образцов и контроля качества является обогащение последовательностей горячих точек рака с помощью мультиплексной ПЦР в одной пробирке. Ген-специфическая или gsPCR будет проводиться для обогащения 46 локусов в 21 гене рака.

Приготовьте достаточное количество мастер-смеси для gsPCR в микроцентрифужной пробирке, используя следующие объемы на образец: пять микролитров мастер-смеси с 2-кратной амплификацией и один микролитр панели пан-ракового праймера. Внесите шесть микролитров мастер-теста gsPCR в каждую лунку 96-луночного планшета. Добавьте по четыре микролитра каждого образца нуклеиновой кислоты в отдельные лунки.

Перемешайте пипеткой вверх и вниз пять раз. Включите соответствующие элементы управления. Поместите герметичную пластину в амплификатор для следующих циклов ПЦР.

Пять минут при 95 градусах Цельсия. 15 секунд при 95 градусах Цельсия, затем четыре минуты при 60 градусах Цельсия в течение двух циклов. 15 секунд при 95 градусах Цельсия, а затем четыре минуты при 72 градусах Цельсия в течение 23 циклов.

Окончательное продление на 10 минут при температуре 72 градуса Цельсия, а затем удержание на четырех градусах Цельсия. После геноспецифической ПЦР выполните 10 циклов ПЦР-меток, чтобы внедрить адаптеры, специфичные для платформы, для совместимости с секвенированием следующего поколения. Добавьте 7,5 микролитров мастер-смеси с индексом 2x и 5,5 микролитров индексного кода в указанную лунку в планшете на 96 лунок и перемешайте с помощью пипетирования вверх и вниз пять раз.

Осторожно откройте планшет для gsPCR и добавьте два микролитра продукта gsPCR в новую пластину с мастер-смесью. Поместите герметичную пластину в амплификатор для следующих циклов ПЦР: пять минут при 95 градусах Цельсия, 30 секунд при 95 градусах Цельсия, 30 секунд при 55 градусах Цельсия и одна минута при 72 градусах Цельсия на 10 циклов и окончательное продление на 10 минут при 72 градусах Цельсия. Затем следует удержание на уровне четырех градусов по Цельсию.

После ПЦР с метками очистка библиотеки и выбор размера осуществляются с помощью магнитной химии шариков. Начните эту процедуру с добавления 11 микролитров библиотечных чистых магнитных шариков в отдельные лунки 96-луночной пластины. Откройте планшет tag-PCR и добавьте 10 микролитров продукта tag-PCR в шарики и перемешайте, пипетируя вверх и вниз пять раз.

Выдерживайте смесь в течение четырех минут при комнатной температуре. Поместите 96-луночную пластину на магнитную подставку на четыре минуты. Пока планшет на 96 лунок все еще находится на подставке, извлеките и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки.

После двукратной промывки бусин с содержащим этанолом промывочным буфером, как описано в тексте протокола, просушите бусины в течение двух минут при комнатной температуре, а затем снимите пластину с подставки. Повторно суспендируйте шарики, добавив 20 микролитров элюирующего буфера в каждую лунку и пипетируя вверх и вниз пять раз. Выдерживать в течение двух минут при комнатной температуре.

Поместите планшет на 96 лунок обратно на магнитную подставку на четыре минуты и осторожно извлеките и перенесите 18 микролитров прозрачной надосадочной жидкости в лунку в новой 96-луночной пластине. Следующим шагом в этом протоколе является количественная оценка каждой очищенной библиотеки образцов с помощью сравнительной конкурентной ПЦР в реальном времени. Чтобы начать эту процедуру, приготовьте достаточное количество мастер-смеси LQ в микроцентрифужной пробирке, используя следующие объемы на образец: пять микролитров 2x LQ мастер-смеси, два микролитра смеси праймер-зонда LQ, 0,5 микролитра стандарта LQ и 0,5 микролитра LQ ROX.

Добавьте 8 микролитров мастер-смеси LQ в лунку оптической 96-луночной пластины. В отдельные лунки добавьте два микролитра последовательного разведения библиотеки, два микролитра положительного контроля LQ и два микролитра разбавителя LQ и перемешайте, пипетируя вверх и вниз пять раз. Поместите запечатанную пластину в систему ПЦР и назначьте детекторы FAM и VIC для каждого образца.

Выполните амплификацию ПЦР в следующих условиях цикла: пять минут при 95 градусах Цельсия и 15 секунд при 95 градусах Цельсия, а затем одну минуту при 60 градусах Цельсия в течение 40 циклов. Затем рассчитывается концентрация каждого образца, как описано в тексте протокола. После количественного определения библиотеки каждая библиотека образцов нормализуется на основе измеренной концентрации и объединяется в одну пробирку для секвенирования.

Упрощенный модуль анализа используется для облегчения вычислений для нормализации библиотек и объединения выборок. Чтобы нормализовать библиотеку, сначала определите медианную концентрацию в наномолярах для всех образцов, каждый из которых содержит уникальный попарный индекс для объединения. Затем определите объем отдельного образца в микролитрах для объединения, умножив медианную концентрацию по всем образцам на пять, а затем разделив на его индивидуальную концентрацию.

Добавьте нормализованный объем для каждого образца в одну микроцентрифужную пробирку, чтобы создать пул образцов. Разбавьте пул образцов до 1,25 наномоляра с помощью разбавителя секвенирования. Подготовьте пул образцов к секвенированию путем его денатурации в присутствии phix control V3. Объедините следующие компоненты: 15 микролитров 1,25 наномолярного пула образцов, три микролитра 0,5 наномолярного фикса и два микролитра 1N гидроксида натрия.

После короткого вортса и центрифугирования выдерживать в течение пяти минут при комнатной температуре. Добавьте 8 микролитров денатурированной библиотеки к 992 микролитрам предварительно охлажденного высокого буфера HT1 в микроцентрифужной пробирке. Добавьте 600 микролитров денатурированной и разбавленной библиотеки в позицию No 17 картриджа с реагентами.

В микроцентрифужных пробирках отдельно разбавьте четыре микролитра каждого праймера секвенирования 636 микролитрами высокого буфера HT1. Добавьте 600 микролитров разбавленных праймеров для секвенирования read-1 в позицию No 18 картриджа с реагентами для секвенирования. 600 мкл разбавленных индексных праймеров чтения в позицию No 19 и 600 мкл разбавленных праймеров секвенирования чтения-2 в позицию No 20.

Загрузите реагенты на прибор для секвенирования нового поколения и выполните парный цикл секвенирования два по 150 циклов в соответствии с инструкциями производителя. Наконец, проанализируйте данные секвенирования с помощью сопутствующего программного обеспечения для биоинформатики. В общей сложности 90 сэмплов могут быть обработаны за один прогон NGS с помощью настольного секвенсора.

Для показанного набора данных образцы включали клеточную линию, остаточный клинический формальный и фиксированный парафин, или FFPE, а также синтетическую матричную ДНК, что привело к высокоглубокому секвенированию и равномерному покрытию. Выбросы состояли из контрольных образцов без матрицы, серии разведения одной ДНК клеточной линии с амплификацией большого числа копий и одной ДНК FFPE, которая была помечена для ингибирования ПЦР с помощью преаналитического анализа QC на основе количественной ПЦР. Однородность покрытия по 46 ампликонам поддерживалась с использованием трех разных операторов и для различных образцов ДНК FFPE низкого качества.

В FFPE контрольная смесь ДНК опухоли, состоящая из известной мутации 5% BRAF V600E, имела целевую мутацию BRAF в среднем 5,2 плюс-минус 1,3 процента тремя операторами с использованием входных 400 амплифицируемых копий. Показано, что разведения образцов клеточной линии и FFPE ДНК с амплификацией числа копий делает зависимость от амплификации EGFR и KRAS. В скором времени ввод ДНК FFPE может быть уменьшен до 50 амплифицируемых копий или 1,2 нанограмма объемной ДНК.

При этом сохраняется обнаружение известных мутаций без ложноположительных вызовов. После освоения эта техника может быть выполнена за 11 часов, при этом около трех с половиной часов работы вручную для партии из 24 образцов за раз, если она выполнена правильно.