Купфер Выделение клеток для наночастиц токсичности тестирования

Общая цель данного эксперимента заключается в выделении и очистке чашечки мыши для клеток в большом количестве для изучения токсичности наночастиц. Это достигается путем перфузии печени мыши раствором H-B-S-S-E-G-T-A и коллагеном, раствором для бережного переваривания тканей печени. Затем клетки печени очищают с помощью плотности, центрифугирования и селективной адгезии для получения культуры очищенной чашки для клеток.

Затем проводится анализ проточной цитометрии с целью подтверждения чистоты и кислотных свойств F чаши для клеток. Получены результаты, которые показывают, что токсичность функционализированных углеродных нанотрубок может быть измерена в чашке для клеток. На основе модифицированного L-D-H-S-A эта модель может быть применена для испытаний на токсичность наночастиц.

Метод, который мы стремимся показать вам сегодня, может помочь ответить на ключевые вопросы в области нанотоксикологии, такие как оценка токсичности недавно разработанных носителей лекарств, это очень важно, поскольку большинство используемых иммортализованных клеточных линий демонстрируют значительно отличающиеся свойства от тканей, из которых они были получены. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение. Если метод будет выполнен успешно, это приведет к получению высокого выхода и чистоты келеек, которые затем могут быть использованы в качестве модели для скрининга ряда наночастиц на эту токсичность.

После свежего приготовления всех реагентов, перечисленных в таблице материалов и найденных реагентов с сопроводительным текстовым протоколом, подогрейте раствор E-G-T-A-H-B-S-S и раствор коллагеназы при температуре 40 градусов Цельсия в течение 30 минут, используйте 70% этанол для промывки гибкой трубки насоса. Затем налейте 40 миллилитров раствора E-G-T-A-H-B-S-S в центрифужную трубку, погруженную в водяную баню, и с помощью предварительно подогретого раствора E-G-T-A-H-B-S-S промойте гибкую трубку насоса. После усыпления CD одной мыши, согласно текстовому протоколу, сбривают волоски на животе и используют 70% этанол для дезинфекции брюшной поверхности.

Подтвердите анестезию пощипыванием пальцев ног. Разрежьте брюшную полость и обнажите воротную вену и нижнюю полую вену, переместив кишечник латерально влево от брюшной полости. Запустите насос со скоростью от одного до трех миллилитров в минуту с помощью раствора E-G-T-A-H-B-S-S и с помощью иглы-бабочки 23 калибра канюлируйте воротную вену, зажмите канюлированный участок воротной вены, а затем переверните синусоидальные щипцы на поверхности вскрытого брюшка мыши.

Печень должна стать бледной в течение первых 30 секунд перфузии, быстро надрезать нижнюю часть нижней полой вены, чтобы избежать избыточного давления в печени, и постепенно увеличивать скорость потока до семи миллилитров в минуту в течение первой минуты перфузии. Когда в центрифужной пробирке остается менее пяти миллилитров раствора E-G-T-A-H-B-S-S. Добавьте от 40 до 50 миллилитров коллагена в раствор, затем постепенно увеличивайте скорость потока до 10 миллилитров в минуту в течение 30 секунд.

Заставьте печень набухнуть, периодически с помощью пинцета надавливайте на нижнюю полую вену с интервалом от 10 до 32-го интервала. Это улучшит диссоциацию клеток и сократит время перфузии с коллагеназой. Когда в пробирке центрифуги останется менее 10 миллилитров раствора коллагеназы, добавьте в пробирку еще от 40 до 50 миллилитров предварительно теплого раствора коллагеназы.

Затем, как только будет перфузировано от 70 до 80 миллилитров, используйте щипцы для легкого давления на поверхность. Впадина указывает на то, что клетки печени диссоциированы. Извлеките печень из брюшной полости как единое целое и поместите ее в центрифужную пробирку, содержащую от 20 до 30 миллилитров стакана для выделения клеток. Терпимая.

Держите клетки печени на льду до трех часов и соберите до трех печени для очистки, чтобы очистить чашу для клеток. Поместите одну перфузированную печень в чашку Петри с чашкой объемом 15 миллилитров для выделения клеток, среднюю – ножницами или пинцетом. Разорвите капсулу глистенса и высвободите все клетки печени в среду.

Отфильтруйте раствор через сетчатый фильтр для клеток размером 100 микрометров в центрифужную пробирку. Затем центрифугируйте клеточную суспензию при 50 GS при четырех градусах Цельсия в течение двух минут. Паренхиматозные клетки будут находиться в грануле, а непаренхиматозные клетки — в надосадочной жидкости.

Соберите надосадочную жидкость в чистую пробирку центрифуги и центрифугируйте при давлении 50 г в течение двух минут. Повторите в общей сложности четыре перевода и вращения. Далее центрифуга.

Супернат на 1, 350 GS на 15 минут. Для гранулирования непаренхиматозных клеток выбросьте супернат и повторно суспендируйте гранулу в 10 мл стакана для среды для изоляции клеток, добавьте раствор непаренхиматозных клеток в прерывистый 25 50% изотонический градиент, предварительно приготовленный в соответствии с текстовым протоколом, и центрифугируйте при 850 GS в течение 15 минут без ускорения или перерыва. Используя серологическую пипетку объемом 10 миллилитров, аспирируйте около 12 миллилитров обогащенной чашки для клеточной фракции, которая выглядит мутной в пределах фракции 25% SIP, близкой к границе раздела 25 50% SIP.

Перенесите клетки в центрифужную пробирку, содержащую от 35 до 40 миллилитров стакана для выделения клеток, среду и осторожно перемешайте, затем центрифугируйте при 1 350 GS и четырех градусах Цельсия для гранулирования клеток, выбросьте супер и используйте от пяти до 10 миллилитров предварительно теплой среды для ресуспендирования клеток с помощью гемоцитометра. Подсчитайте ячейки и используйте окрашивание триановым синим, чтобы измерить пластину жизнеспособности. Очищенные непаренхиматозные клетки в 24 луночных планшетах с плотностью пять умножить на 10 до пятых клеток на лунку.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 30 минут. Затем аккуратно удалите среду. Используйте предварительно подогретый HBSS для промывания клеток и замените его 500 микролитрами на лунку свежей предварительно теплой чашки для среды для клеточных культур.

Верните клетки до 37 градусов Цельсия не менее чем на четыре часа, чтобы дать клеткам возможность прилипнуть перед обработкой наночастицами. После определения характеристик чистоты и фагоцитарной активности С для клеток и инкубации с функционализированными углеродными нанотрубками или ФКТС, как указано в текстовом протоколе, выбросьте надосадочную жидкость и добавьте 200 микролитров буфера для лизиса на лунку. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30-60 минут, проведите энергичное пипетирование и соберите выложенный стаканчик для клеток в микроцентрифужные пробирки.

Затем центрифугируйте при 20 000 GS в течение 10 минут, чтобы извлечь fcn ts, которые были поглощены клетками на клеточном мусоре. Соберите надосадочную жидкость в микроцентрифужные пробирки и храните ее при температуре минус 20 градусов Цельсия. В качестве альтернативы перелейте 50 микролитров в 96-луночный планшет и добавьте равный объем раствора субстратной смеси из набора лактатдегидрогеназы.

В состав входят тройные глухие лунки, содержащие 50 микролитров буфера для лизиса и 50 микролитров раствора субстратной смеси. Затем накройте тарелку крышкой и выдерживайте при комнатной температуре в течение 15 минут, прежде чем добавить 50 микролитров стоп-раствора. Наконец, считайте поглощение на 490 нанометрах в считывателе микропланшетов и используйте следующую формулу для расчета процента жизнеспособности клеток.

Этот рисунок показывает, что количество очищенных непаренхиматозных клеток колеблется от восьми до 14 умножить на 10 до шести клеток на мышь и триан. Окрашивание в синий цвет продемонстрировало примерно 95% жизнеспособности клеток. Адгезивная чашка для клеток приняла круглую форму в течение 30 минут инкубации, и через четыре часа клетки распространились и начали формироваться кластеры, как показано здесь.

Клетки окрашивали антителом F 4 80 для демонстрации чашечки для чистоты клеток, которая была измерена выше 95% с помощью проточной цитометрии. Кроме того, после 12 часов в культуре анализ низкой цитометрии показал, что 85% клеток способны к кислотной активности PHA благодаря своей способности поглощать флуоресцентные шарики размером в один микрометр. Однако это число снизилось через 72 часа в культуре, когда только 40% клеток были фагоцитарными.

Чашка для клеток, инкубированных с функционализированными углеродными нанотрубками в течение 24 и 72 часов, имела схожую морфологию по сравнению с наивными клетками. Напротив, чашка для клеток, инкубированных с 10% ДМСО, используемая в качестве положительного контроля, показала некротическую морфологию после анализа модифицированной чашки для анализа LDH для клеток, обработанных 10% ДМСО в течение 24 и 72 часов, показала высокую токсичность. Следуя этому методу, другие клеточные СК и все типы наночастиц могут быть протестированы с использованием изолированных кеклеточных клеток.

Это позволяет собирать достоверные данные, сводя к минимуму использование животных. Мы надеемся, что этот метод поможет исследователям в области нанотехнологической психологии проверить безопасность многих перспективных наноносителей, которые все чаще разрабатываются.