Слой за слоем Коллаген осаждения в микрофлюидных Устройства для стабилизации Microtissue

Общая цель этой процедуры заключается в нанесении тонкой коллагеновой сборки на клетки в микрофлюидном устройстве. Это достигается путем предварительной модификации подкисленного нативного коллагена путем метилирования для создания чистых положительно заряженных молекул коллагена. Второй шаг заключается в модификации подкисленного нативного коллагена с помощью синтеза для создания отрицательно заряженных молекул коллагена.

Затем подготавливаются микрофлюидные устройства и засеваются гепатоцитами, которые прикрепляются и распространяются на ночь. Заключительным этапом является депонирование коллагеновой сборки путем поочередного воздействия на клетки положительно и отрицательно заряженных коллагеновых растворов для создания 10 бислоев коллагена поверх клеточного слоя. В конечном счете, фазовая и иммунофлуоресцентная микроскопия, а также анализы альбумина и мочевины используются для демонстрации развития и поддержания полярности клеток и секреторной функции.

Основные преимущества этой методики заключаются в том, что она позволяет культивировать гепатоциты в микроустройствах с использованием методов, аналогичных тем, которые применяются в планшетных культурах на протяжении более 20 лет. Он не требует сложных конструкций устройств, а наплавленная матрица очень тонкая — порядка 100 нанометров. Впервые идея этого метода пришла нам в голову во время мозгового штурма о том, как перенести методы культивирования клеток класса Capy с планшетов на микрофлюидные устройства.

Метод коллагенового сэндвича работает в микроскопических системах с открытым верхом, но используемые гидрогели несовместимы с закрытыми микроустройствами с ограниченной высотой каналов. Разведите 100 мг нативного раствора подкисленного коллагена до концентрации 0,5 мг на миллилитр льдом, холодной, стерильной водой, и поместите раствор на лед, чтобы предотвратить алацию. Затем отрегулируйте pH коллагенового раствора до 9-10 с помощью нескольких капель одного нормального гидроксида натрия и осторожно перемешайте раствор при комнатной температуре в течение 30 минут.

По мере того, как коллаген выпадает в осадок, раствор начнет мутнеть, раскрутите осажденный раствор коллагена, который в 3000 раз больше G, в течение 25 минут. После этого на дне пробирок должен быть виден прозрачный гелеобразный осадок, отсасывать нат, а затем ресуспендировать выпавший коллаген в 200 миллилитрах метанола с 0,1 нормальной соляной кислоты, дать возможность реакции метилирования произойти при перемешивании при комнатной температуре в течение четырех дней после центрифуги метилирования, раствором в 3000 раз G в течение 25 минут для гранулирования метилированного коллагена, Затем аспирируйте и утилизируйте подкисленный метанола супинат. Затем растворите метилированный коллаген в 25 миллилитрах стерильного PBS и отфильтруйте раствор через сетчатое фильтр для клеток размером 60 микрон.

Отрегулируйте pH раствора от 7,3 до 7,4, используя 20 микролитров одного нормального гидроксида натрия. Оцените концентрацию коллагенового раствора с помощью коммерческого набора для анализа коллагена ELIZA на крысах или набора для анализа гидроксипролина. Затем разведите раствор до трех миллиграмм на миллилитр стерильным PBS.

Стерилизуйте раствор метилированного коллагена, переложив его в стеклянную бутылку с завинчивающейся крышкой. Тщательно насыпьте три миллилитра хлороформа на дно бутылки и дайте бутылке застыть на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. На следующее утро.

Асептически удалите верхний метилированный слой коллагена. Храните метилированный коллаген при температуре четыре градуса Цельсия и используйте его в течение одного месяца. Разведите еще 100 миллиграммов нативного раствора подкисленного коллагена до концентрации 0,5 миллиграмма на миллилитр со льдом, холодной стерильной водой и поместите раствор на лед, чтобы предотвратить свидания, как было показано ранее, отрегулируйте pH раствора коллагена гидроксидом натрия и перемешайте раствор при комнатной температуре, чтобы высадить коллаген в осадок.

Далее растворите 40 миллиграмм шести цинических ангидридов в 10 миллилитрах ацетона. Медленно добавляйте эту смесь с шагом 0,5 миллилитра в раствор коллагена, помешивая и непрерывно контролируя pH раствора. Поддерживайте pH выше 9,0, добавляя одну или две капли одного нормального гидроксида натрия, когда pH приближается к 9,0, непрерывно перемешивайте при комнатной температуре в течение 120 минут.

После добавления всех шести циных и гидридных растворов наблюдайте, как смесь становится прозрачной по мере растворения сукцинатного коллагена, продолжайте периодически проверять pH, чтобы убедиться, что он остается выше 9,0. Когда весь сукцинатный коллаген растворится, отрегулируйте pH раствора до 4,0, используя 20 микролитров одной нормальной соляной кислоты. Наблюдайте за раствором, снова помутнейте по мере выпадения сукцинатного коллагена.

Затем центрифугируйте раствор при 3000 умноженных на G в течение 25 минут. Для гранулирования сукцинатного коллагена Асбери и утилизации подкисленного сната с нереактивным ангидридом сника растворите сукцинатный коллаген с помощью повторного пипетирования в 25 миллилитрах стерильного PBS с получением конечной концентрации примерно три миллиграмма на миллилитр. Затем отфильтруйте раствор через сетчатый фильтр с ячейкой 60 микрон, а затем отрегулируйте pH раствора до 7,3-7,4.

Используя 20 микролитров одного нормального гидроксида натрия, оцените концентрацию раствора с помощью коммерческого набора ELIZA для коллагеновых крыс или набора для анализа гидроксипролина. Затем разведите раствор до трех миллиграмм на миллилитр. С помощью стерильного PBS стерилизуйте этот раствор коллагена так же, как и раствор метилированного коллагена.

Начните с изготовления микрофлюидного устройства с использованием стандартной технологии, которое имеет камеры для клеточных культур высотой 100 микрон, шириной от 0,4 до 1,5 миллиметра и длиной от одного до 10 миллиметров для роста клеток. Используйте плазменный очиститель для окисления поверхностей устройства и предметное стекло. Затем прижмите их друг к другу, чтобы образовалась связь.

После стерилизации устройства путем воздействия ультрафиолетового излучения в течение не менее 30 минут. Заполните камеру 15 микрограммами на миллилитр, фибронектином в стерильном PBS и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 45 минут. Далее посмотрите устройство с ячейками, как описано в сопроводительном текстовом протоколе.

В ламинарном проточном тканевом культуре приготовьте достаточные объемы метилированных и атированных растворов коллагена для 10 применений каждого раствора на устройство, а также несколько экстремальных миллилитров среды. Держите растворы на льду. Чередуйте промывку приборов 20 микролитрами метилированных, а затем насыщенных растворов коллагена.

Ожидание одной минуты между каждым применением. Промойте устройство в общей сложности 10 раз на раствор. Работайте быстро, чтобы свести к минимуму количество времени, в течение которого клетки находятся без среды, в то время как растут слои коллагена, можно наблюдать, как коллаген медленно накапливается на входе и выходе микрофлюидного устройства.

Если сопротивление потоку жидкости увеличивается, промойте устройство один или два раза фильтрующим материалом, а затем продолжайте наслаивание. После нанесения всех слоев дважды промойте устройство свежим материалом и верните в инкубатор. Метилирование и ионирование изменяют зарядовые характеристики молекул коллагена.

Он удаляет положительно заряженные группы и заменяет их отрицательно заряженными группами, а метилирование удаляет отрицательно заряженные группы, создавая чистые положительно заряженные молекулы, что позволяет слой за слоем осаждать два варианта коллагена на заряженных поверхностях, таких как клетки. Первичные гепатоциты, засеянные на стекло с фибронектиновым покрытием в микрофлюидном устройстве, могут быть покрыты этим слой за слоем. Сборка коллагенового матрикса, нанесение 10 бислоев на клетки создает слой коллагена толщиной примерно 140 нанометров гепатоцитов без верхнего коллагенового слоя за слоем.

Матрицы теряют свой дифференцированный фенотип и со временем отрываются от поверхности микрофлюидных устройств. Напротив, гепатоциты, покрытые ультратонкой коллагеновой структурой, сохраняют свою дифференцированную морфологию, жизнеспособность более 90% и поляризацию в течение 14 дней. В дополнение к морфологии жизнеспособности клеток и поляризации, метод послойного осаждения коллагена также восстанавливает и стабилизирует функцию первичных гепатоцитов, как указано здесь, После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как метилировать и сукцинировать коллаген для создания чистых положительно и отрицательно заряженных коллагеновых растворов и как использовать их при послойном осаждении для создания тонких коллагеновых сборок на вершине клеток в микрофлюидных устройствах.