Протокол трехмерной конфокальной морфометрического анализа астроцитов

Общая цель этой процедуры заключается в оценке морфологии астроцитов путем анализа трехмерных изображений астроцитов, полученных с помощью конфокальной микроскопии. Этот метод может быть использован для оценки морфологических изменений, которые могут появиться в различных типах клеток, либо при патологических состояниях, либо в результате стратегии вмешательства. Основное преимущество этой методики заключается в том, что многие параметры, связанные с клеточной архитектурой, могут быть изучены одновременно.

Доктор Мариам Бодель продемонстрирует эту процедуру: после подготовки стекол для иммуногистохимического окрашивания срезов путем погружения их в ксилол два раза на 10 минут. Инкубируйте предметные стекла в течение 10 минут в 99,8%, 95% и 70% этаноле для регидратации секций после промывки. PBS инкубируют предметные стекла в разведении от одного до 1500 глиального фибриллярного кислого белка или раствора первичного антитела GFAP при четырех градусах Цельсия в течение ночи.

После инкубации промойте секции в PB S3 раз в течение пяти минут. Затем инкубируйте предметные стекла с конъюгированным раствором вторичного антитела от 1 до 100 щелочной фосфатазы в течение одного часа при комнатной температуре. Снова промойте секцию в PB S3 в течение пяти минут, менее чем за 30 минут до использования.

Добавьте одну каплю раствора красного хромогена в три миллилитра субстрат-буфера. Инкубируйте каждое предметное стекло в 100 микролитрах этого раствора в течение 15-20 минут в темноте. Затем промойте слайды в PB S3 раза в течение пяти минут.

Наконец, окрашивайте ядра DPI, разведенным от одного до 500 в PBS. Нанесите одну-две капли средства Antifa на участок и сразу же запечатайте покровным стеклом. Инкубируйте предметные стекла при температуре четыре градуса Цельсия в течение 24–48 часов перед микроскопией, чтобы обеспечить герметичность.

Чтобы начать конфокальную микроскопию, поместите предметное стекло на предметное стекло и выберите объектив с 63 увеличениями. После открытия программного обеспечения для сбора данных нажмите «Умная настройка» на вкладке «Сбор» и выберите подходящий этаж из четверок. Здесь используются dappy и Alexa, этаж 5 55.

Затем нажмите на лучший сигнал, а затем примените. Затем нажмите на «Установить экспозицию», чтобы позволить компьютеру определить оптимальные параметры экспозиции Чтобы оптимизировать изображение, откройте окно каналов и переключите изображение в режим реального просмотра. При необходимости отрегулируйте фокус.

Затем нажмите на одну ау, чтобы оптимизировать отверстие, отрегулируйте усиление для достижения наилучшей интенсивности. Наконец, установите цифровое усиление в диапазоне от двух до трех. После этой оптимизации остановите изображение в реальном времени и откройте окно режима съемки.

Отрегулируйте размер кадра, нажав на X по Y и выберите 10 24 на 10 24. Также выбирайте медленную скорость. Далее откройте вкладку усреднения и выберите число больше или равное четырем.

Затем нажмите кнопку привязки и сохраните отснятое 2D-изображение. Чтобы настроить 3D-визуализацию, откройте вкладку умной настройки и отметьте пункт стека ZS, что приведет к открытию окна стека Zs. Чтобы установить первое и последнее положение для Зака, снова нажмите кнопку live и отрегулируйте фокус на самую верхнюю позицию астроцита.

Сначала нажмите на «Набор». Теперь отрегулируйте фокус в самое нижнее положение астроцита и нажмите на установку последним, затем остановите просмотр в реальном времени. Далее выберите интервал, нажав на оптимальный.

Чтобы задать здесь количество срезов, интервал равен 1,01 микрометра. Наконец, нажмите «Пуск», поэкспериментируйте и сохраните изображения после завершения сканирования. Кроме того, можно получить 2D-изображение с помощью объектива 10 или 20 крат.

Для измерения интенсивности флуоресценции выберите инструмент «Прямоугольник» или «Круг» в окне изображения и выделите область для измерения, чтобы количественно оценить объем и площадь поверхности тела и территории сомы ядра астроцита. Перенесите 3D-изображения в соответствующую программу для анализа, такую как Velocity 6.1 в программном обеспечении для анализа. Создайте новую библиотеку и перетащите все изображения в левый серый столбец.

Выберите одно 3D изображение и включите один из приобретенных интересующих каналов, например dapi. Для ядерных измерений вручную отрегулируйте яркость, чтобы оптимизировать контрастность. Теперь выберите меню «Инструменты».

Выберите «Сделать объем» и создайте одно 3D-изображение из изображений Зака. Откройте меню редактирования и нажмите на свойства. Убедитесь, что свойства X, Y и Z отображаются.

После этого выберите инструмент ROI от руки на панели инструментов. С помощью выбранного инструмента проведите линию вокруг ядра с меткой DPI, чтобы измерить объем и площадь поверхности ядра астроцита. Опять же, используя инструмент ROI от руки, измерьте объем и площадь поверхности всего астроцита, проведя линию вокруг сомы, повторяющую поверхность всех ветвей.

Нажмите на меню измерений в верхней части окна изображения, перетащите поиск объектов в верхнюю часть окна и дайте описательное имя популяции один, выберите соответствующий цвет и нажмите на меру, после чего откроется новое окно. В этом новом окне. Выберите объем или площадь поверхности в качестве параметра и нажмите OK.

Чтобы сохранить данные, нажмите на меню измерения и выберите пункт «Сделать измерение». Выберите новый элемент измерения, вызываемый в окне. Введите имя файла для данных и нажмите кнопку ОК.

Наконец, экспортируйте данные измерений в соответствующий программный пакет для выполнения статистического анализа и создания графиков данных. Здесь исследователи сравнили астроциты в фиксированной ткани мозга крыс, получавших бета-амилоид 1 40 или бета-амилоид 1 40 и Ян. Лечебная инъекция амилоидного белка привела к образованию астроцитов с более толстыми и длинными ветвями.

Эти астроциты животных, обработанных Яном, имели звездчатую форму с короткими и тонкими ветвями. Крысы, получавшие Ян, также продемонстрировали снижение положительной флуоресценции GFAP астроцитов в срезах мозга. Морфометрический анализ специфических объемов астроцитов показал, что объем ядра астроцита, всего тела астроцита и территории астроцитов был уменьшен при лечении Яна по сравнению с лечением только амилоидом.

После того, как вы освоите это изображение, техника анализа может быть завершена за несколько минут на ячейку, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно отметить структуру с высокой точностью. Лучше всего попрактиковаться в маркировке интересующей структуры вручную перед началом эксперимента после его разработки.

Этот метод проложил путь исследователям в области клеточной биологии, гистологии и патологии к изучению структуры клетки в здоровой или патологической среде. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как измерить 12 различных параметров для одной клетки с помощью 3D-изображений.