Протокол трехмерной конфокальной морфометрического анализа астроцитов

Общая цель данной процедуры — оценить морфологию астроцитов путем анализа трехмерных изображений астроцитов, полученных с помощью конфокальной микроскопии. Этот метод может быть использован для оценки морфологических изменений, которые могут возникать в различных типах клеток либо при патологических состояниях, либо в результате стратегии вмешательства. Основным преимуществом данной методики является возможность одновременного изучения множества параметров, связанных с архитектурой клеток.

Д-р Мариам Бодель продемонстрирует эту процедуру. После подготовки стекол для иммуногистохимического окрашивания депарафинизируйте срезы, погрузив их в ксилол дважды на 10 минут. Инкубируйте стекла по 10 минут в каждом из растворов этанола (99,8%, 95% и 70%) для регидратации срезов после промывки. Инкубируйте стекла в растворе первичных антител к глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP) в разведении 1:1500 в PBS при температуре 4 °C в течение ночи.

После инкубации промойте срезы в PB S 3 раза по пять минут. Затем инкубируйте предметные стекла с раствором вторичных антител, конъюгированных с щелочной фосфатазой, в разведении 1:100 в течение одного часа при комнатной температуре. Снова промойте срез в PB S 3 раза по пять минут, менее чем за 30 минут до использования.

Добавьте одну каплю раствора красного хромогена к трем миллилитрам буфера для субстрата. Инкубируйте каждое стекло в 100 µL этого раствора от 15 до 20 минут в темноте. Затем промойте стекла в PBS 3 раза по пять минут.

В завершение окрасьте ядра с помощью DPI, разведенного в PBS в соотношении 1:500. Нанесите одну или две капли среды Antifa на срез и немедленно накройте предметным стеклом. Инкубируйте препараты при температуре 4 °C в течение 24–48 часов перед микроскопией для обеспечения герметизации.

Для начала конфокальной микроскопии поместите предметное стекло на столик микроскопа и выберите объектив 63 x. После запуска программного обеспечения для сбора данных перейдите во вкладку сбора данных, нажмите «smart setup» и выберите соответствующий набор из четырех каналов. В данном случае используются DAPI и Alexa Fluor 555.

Затем нажмите «best signal», а затем «apply». После этого нажмите «set exposure», чтобы компьютер определил оптимальные параметры экспозиции. Для оптимизации изображения откройте окно каналов и переключите изображение в режим «live». При необходимости отрегулируйте фокус.

Затем нажмите на один au для оптимизации диафрагмы (pinhole), отрегулируйте усиление для достижения наилучшей интенсивности. В завершение установите цифровое усиление (digital gain) в диапазоне от двух до трех. После этой оптимизации остановите получение изображения в реальном времени и откройте окно режима сбора данных.

Отрегулируйте размер кадра, нажав на X by Y, и выберите 10 24 by 10 24. Также выберите низкую скорость. Затем откройте вкладку усреднения и выберите число, большее или равное четырем.

Затем нажмите кнопку snap и сохраните полученное 2D-изображение. Для настройки 3D-визуализации откройте вкладку smart setup и отметьте пункт ZS stack, после чего откроется окно Zs stack. Чтобы установить начальную и конечную позиции для Z-стека, снова нажмите live и отрегулируйте фокус до самого верхнего уровня астроцита.

Сначала нажмите кнопку «set first» (установить первый). Теперь настройте фокус на самую нижнюю точку астроцита, нажмите «set last» (установить последний), после чего остановите режим просмотра в реальном времени. Затем выберите интервал, нажав «optimal» (оптимально).

Для установки количества срезов установите интервал 1,01 мкм. Наконец, нажмите кнопку start, запустите эксперимент и сохраните изображения после завершения сканирования. Также получите 2D-изображение, используя объектив 10x или 20x.

Для измерения интенсивности флуоресценции выберите инструмент «прямоугольник» или «круг» в окне изображения и выделите область измерения для количественного определения объема и площади поверхности сомы (тела клетки) и территории ядра астроцита. Перенесите 3D-изображения в подходящую программу для анализа, например, Velocity 6.1. Создайте новую библиотеку и перетащите все изображения в левый серый столбец.

Выберите одно 3D-изображение и включите один из интересующих вас полученных каналов, например, dapi. Для измерения ядер вручную отрегулируйте яркость, чтобы оптимизировать контраст. Теперь перейдите в меню инструментов.

Выберите «make volume» и создайте одно 3D-изображение на основе снимков Zack. Откройте меню редактирования и нажмите «properties». Убедитесь, что отображаются параметры X, Y и Z.

После этого выберите в панели инструментов инструмент «свободная область» (freehand ROI). С помощью выбранного инструмента обведите ядро, помеченное как DPI, чтобы измерить объем и площадь поверхности ядра астроцита. Затем, снова используя инструмент «свободная область», измерьте объем и площадь поверхности всего астроцита, обведя сому и следуя по поверхности всех отростков.

Нажмите на меню измерений в верхней части окна изображения, перетащите функцию «find objects» в верхнюю часть окна и присвойте описательное имя первой популяции, выберите соответствующий цвет и нажмите «measure», после чего откроется новое окно. В этом новом окне выберите в качестве параметра объем (volume) или площадь поверхности (surface area) и нажмите «okay».

Чтобы сохранить данные, перейдите в меню измерений и выберите пункт «выполнить измерение». В открывшемся окне выберите новый пункт измерения. Введите имя файла для данных и нажмите «ОК».

Наконец, экспортируйте данные измерений в соответствующий пакет программного обеспечения для проведения статистического анализа и построения графиков. В данном случае исследователи сравнивали астроциты в фиксированной ткани головного мозга крыс, которым вводили амилоид-бета 1-40 или амилоид-бета 1-40 и Ian. Инъекция амилоидного белка привела к тому, что астроциты стали иметь более толстые и длинные ветви.

Эти астроциты из животных, получавших Ian, имели звездчатую форму с короткими и тонкими отростками. У крыс, получавших Ian, также наблюдалось снижение GFAP-положительной флуоресценции астроцитов в срезах мозга. Морфометрический анализ объемов отдельных компонентов астроцитов показал, что объем ядра астроцита, тела клетки, всего астроцита и территории астроцита при лечении Ian был снижен по сравнению с группой, получавшей только амилоид.

После освоения данной методики анализа изображений обработка одной клетки может занять всего несколько минут при условии правильного выполнения процедуры. При выполнении данного метода крайне важно размечать структуру с высокой точностью. Рекомендуется потренироваться в ручной разметке интересующей структуры перед началом эксперимента после завершения этапа проявки.

Этот метод открыл перед исследователями в области клеточной биологии, гистологии и патологии возможность изучения структуры клетки в здоровом состоянии или при патологии. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как измерять 12 различных параметров одной клетки с помощью 3D-изображений.