Прикосновение Универсальный мышиной модели подкорковых белого вещества для изучения дегенерации аксонов и белого вещества нейробиологии
17 марта 2016 г.
Здесь мы представляем методологию создания фокального инсульта в белом веществе мыши путем локальной инъекции необратимого ингибитора эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS) (L-Nio). Представлены два стереотаксических варианта: ретроградная трассировка нейронов и маркировка и диссекция свежих тканей, которые расширяют потенциальные возможности применения этого метода.
Общая цель данной процедуры заключается в точном локализовании небольшого инсульта в белом веществе головного мозга мыши для моделирования этой распространенной формы субкортикального инсульта белого вещества. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследования инсультов, такие как механизмы аксонального повреждения, нейрональный ответ на субкортикальный инсульт, а также то, как клеточные элементы белого вещества реагируют как в острой фазе, так и в фазе восстановления после инсульта. Основным преимуществом данного метода является возможность точной локализации инсульта в белом веществе, а также возможность его применения на широком спектре моделей мышей.
Как правило, специалисты, впервые применяющие данный метод, могут столкнуться с трудностями из-за малого объема белого вещества, что приводит к неправильному определению локализации инсульта. Для каждой линии мышей могут потребоваться незначительные корректировки угла введения или стереотаксических координат, а также настроек стереотаксической установки. Начните с закрепления вытянутой стеклянной пипетки на трубке, подключенной к вакуумной линии.
Погрузите вытянутый конец в раствор L-Nio или L-Nio с флуоресцентным трейсером. Включите вакуум и создавайте всасывание до тех пор, пока не будет заполнено не менее двух миллиметров участка пипетки диаметром 0,5 миллиметра. Отставьте заполненную пипетку в сторону.
Затем поместите мышь в стереотаксический аппарат, оснащенный стереотаксическим микроскопом. После введения анестезии и подготовки мыши к операции в соответствии с утвержденными процедурами проверьте глубину наркоза с помощью щипкового теста (нажатия на пальцы лапы). Реакция должна отсутствовать.
Затем установите угол наклона манипулятора для инъекций на 36 градусов. Закрепите держатель вытянутой стеклянной пипетки на дистальном конце системы нагнетания давления для малых объемов и присоедините его к манипулятору. После выполнения среза кожи скальпа по срединной линии длиной 1,5 сантиметра для обнажения черепа, просушите поверхность черепа ватным тампоном.
Затем, глядя через стереомикроскоп с увеличением от 1 до 3 крат, с помощью микроинструмента удалите нависающую надкостничную ткань. Отметьте брегму тонким маркером. После этого с помощью хирургического сверла, оснащенного тонким сверлом, выполните эллиптическую краниотомию диаметром 2 мм, начиная с задней части от брегмы и продвигаясь вперед чуть левее срединной линии.
Удалите фрагменты кости и перекрывающие их мягкие ткани, чтобы стала видна кора головного мозга. Поддерживайте поверхность коры влажной, периодически нанося капли стерильного физиологического раствора. Затем закрепите заполненную пипетку на рычаге инъектора.
Совместите дистальный конец пипетки с брегмой и обнулите стереотаксические координаты. Переместите пипетку к первой точке инъекции, используя передние, задние и медиально-латеральные координаты, указанные в таблице 1. Затем опустите пипетку до поверхности коры и обнулите измерение по дорсо-вентральной оси.
Медленно опустите пипетку до соответствующих дорсо-вентральных координат. Убедитесь, что увеличение стереомикроскопа установлено на 3X и что калиброванная сетку отчетливо видна. Расположите пипетку под углом и смотрите на нее сбоку так, чтобы мениск воздуха и жидкости был виден в сагиттальной плоскости.
Мениск должен находиться в одной фокальной плоскости как с внутренней, так и с внешней стенкой пипетки. Теперь, используя систему локального инъекционного давления, настроенную на 20 PSI с длительностью импульса 20 миллисекунд, введите 100 нанолитров L-Nio в мозг. После введения всего объема подождите пять минут, чтобы предотвратить рефлюкс по каналу пипетки.
Затем извлеките пипетку и повторите процедуру инъекции во втором и третьем наборах координат, указанных в таблице 1. После последней инъекции удалите пипетку и нанесите достаточное количество костного воска, чтобы заполнить место краниотомии. В завершение соедините края раны на скальпе и зафиксируйте их дермальным адгезивом.
После проведения послеоперационной анальгезии поместите животное в чистую клетку. Обеспечьте прием послеоперационных антибиотиков с питьевой водой в течение пяти дней или до момента эвтаназии, если этот срок составляет менее пяти дней. После эвтаназии и декапитации мыши в соответствии с утвержденными процедурами, используя стерильные ножницы, вскройте череп сзади, затем с помощью шпателя аккуратно удалите вышележащие части костей черепа.
Затем вставьте стерильный шпатель шириной 4 мм в переднюю часть мозга, чтобы перерезать обонятельные луковицы и зрительные нервы. После этого осторожно извлеките мозг из черепной коробки и поместите его в ледяной диссекционный буфер. С помощью фиксатора для мозга и стерильных лезвий бритвы сделайте срезы толщиной 2–3 мм, содержащие пораженную область, и поместите их в холодный диссекционный буфер.
Под диссекционным микроскопом определите белое вещество, расположенное под моторной корой в инъекционном полушарии. На ранних интервалах после инсульта инъекция L-Nio в смеси с обычными лабораторными красителями, такими как fast green, может позволить визуально идентифицировать зону инсульта. На более поздних интервалах после инсульта данную область можно определить визуально по фокальному некрозу и бледности миелина.
После идентификации области используйте скальпель для осторожного препарирования участка белого вещества, в котором произошел инсульт. При необходимости удалите перекрывающую кору и подлежащее полосатое тело. Как показано здесь, иммунофлуоресцентное окрашивание нейрофиламентов (красный цвет) при использовании медиального подхода демонстрирует степень потери аксонов через семь дней после инсульта.
При использовании заднего углового подхода мишенью является очаг ишемического повреждения белого вещества, расположенный непосредственно над боковым желудочком; в этой области наблюдается интенсивная микроглиальная реактивность, выявленная с помощью иммуномаркирования IBA-1. Два маркера промежуточных филаментов астроцитов — виментин (показан красным) и глиальный фибриллярный кислый белок (показан зеленым) — демонстрируют изменения морфологии астроцитов белого вещества после инсульта. Совместное введение флуоресцентного декстрана-амина в момент индукции инсульта позволяет идентифицировать отдельные нейроны с аксонами, поврежденными в результате инсульта.
Большая часть меток обнаруживается в аксонах нейронов пятого и шестого слоев первичной сенсомоторной коры, расположенной над зоной инсульта. Данное изображение соответствует седьмому дню после инсульта. При должном освоении эта методика может быть выполнена за 45 минут, если соблюдать правильный порядок действий.
После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как вызвать фокальный инсульт белого вещества у мыши и подготовить мозг к различным последующим методам анализа, необходимым для поиска ответов на важные вопросы в области изучения инсульта и восстановления нервной ткани.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлена методика моделирования очагового инсульта в белом веществе головного мозга мышей путем локального введения необратимого ингибитора eNOS (L-Nio). Метод включает стереотаксические модификации и маркировку свежей ткани для расширения возможностей его применения в исследованиях инсульта.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Исследования инсульта
- Мышиные модели
Теоретические основы
- Очаговые инсульты в белом веществе часто встречаются в моделях субкортикального инсульта.
- Понимание механизмов аксонального повреждения и нейронального ответа имеет решающее значение в исследованиях инсульта.
- Точная локализация очагов инсульта может улучшить результаты экспериментов.
- Различия между линиями мышей могут потребовать корректировки методики.
Цель исследования
- Для точного моделирования инсульта в подкорковом белом веществе у мышей.
- Для изучения механизмов аксонального повреждения и нейрональных ответов.
- Для исследования клеточных ответов в острой фазе и фазе восстановления после инсульта.
Используемые методы
- Введение L-Nio с использованием стереотаксического аппарата.
- Подготовка мыши и хирургические процедуры по индукции инсульта.
- Диссекция и маркировка тканей мозга для анализа.
- Иммунофлуоресцентное мечение для оценки потери аксонов и реактивности микроглии.
Основные результаты
- Успешная локализация очагов инсульта в белом веществе головного мозга мыши.
- Идентификация аксональных повреждений и активации микроглии после инсульта.
- Визуализация инсульта с использованием флуоресцентных трейсеров.
- Демонстрация астроцитарных изменений в ответ на инсульт.
Выводы
- Этот метод позволяет точно моделировать инсульты с поражением белого вещества.
- Он дает представление о клеточных механизмах повреждения при инсульте.
- Применение данного метода в будущем может углубить понимание процессов восстановления после инсульта.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Моделирование фокального инсульта белого вещества у мышей восполняет критический пробел в доклинических исследованиях инсульта, позволяя механистически снизить риски при изучении путей аксональной дегенерации. Данная модель способствует валидации мишеней, предоставляя релевантную патологии систему для изучения нейровоспалительных реакций и процессов восстановления, характерных для сосудистой деменции и бремени «немых» инфарктов. Точная локализация очага поражения повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска новых лекарственных средств за счет снижения биологической вариабельности показателей в последующих анализах.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, касающиеся механизмов повреждения аксонов при патологии белого вещества.
- Практическая ценность: предоставляет совместимую с мышиными моделями платформу для функциональной валидации мишеней с использованием общепринятых нейробиологических инструментов.
- Научная ценность: способствует снижению биологических рисков за счет моделирования вклада немых инфарктов в прогрессирование сосудистой деменции.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные гистологические показатели, такие как потеря аксонов и микроглиальная реактивность, для стандартизации анализа.
- Практическая ценность: облегчает подготовку валидированных срезов тканей для воспроизводимого иммунофлуоресцентного анализа и анализов с использованием трейсеров.
- Научная ценность: обеспечивает готовность к скринингу за счет индукции фокальных повреждений, совместимых с ретроградным нейронным трейсингом и маркированием свежей ткани.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Соответствует системам, имеющим отношение к заболеванию, путем моделирования инсульта в подкорковом белом веществе, способствующего развитию сосудистой деменции.
- Операционная ценность: Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации за счет стандартизированного стереотаксического введения и обработки тканей.
- Научная ценность: Поддерживает принятие решений о продвижении проекта с учетом рисков, связывая локализацию очага поражения с профилями клетоного ответа в острых и восстановительных фазах.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего поиска лекарственных средств, позволяя проверять гипотезы о механизмах инсульта, специфичных для белого вещества, еще до начала этапа идентификации перспективных соединений.
- Открывающая биология: способствует уточнению путей передачи сигналов посредством направленного индуцирования повреждений в трактах белого вещества мышей.
- Скрининг: позволяет получать готовые к анализу ткани с количественными показателями, такими как активация микроглии IBA-1+ и потеря аксональных филаментов.
- Аналитика: предоставляет измеримые зависимые переменные, включая интенсивность флуоресценции нейрофиламентов и астроцитарных маркеров для сравнительного анализа условий.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преклиническую преемственность за счет моделирования фаз инсульта, имеющих значение для сосудистых когнитивных нарушений.
- Повторное использование в организации: предлагает применимую повторно стереотаксическую схему, адаптируемую для различных линий мышей и комбинаций трейсеров для лонгитюдных исследований.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает прогностическую уверенность в валидации мишени за счет снижения механистической неопределенности в моделях повреждения белого вещества.
- Практическая ценность: повышает воспроизводимость благодаря стандартизированным координатам, параметрам инъекций и протоколам диссекции тканей.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет обеспечения ранней оценки взаимодействия с мишенью в путях аксональной дегенерации.
- Влияние на портфель: обосновывает приоритетность с учетом рисков путем моделирования широко распространенного, но недостаточно изученного подтипа инсульта, связанного с риском развития деменции.
Особенности реализации
- Требуется опыт в стереотаксической хирургии и нейроанатомии мышей для точного воздействия на белое вещество.
- Результат зависит от использования откалиброванных систем инъекционного давления и стерильных микрохирургических инструментов для стабильного индуцирования повреждений.
- Необходима межкомандная стандартизация протоколов гистологического окрашивания и визуализации для обеспечения воспроизводимости результатов в разных центрах.
- При применении данной модели для разных генетических линий мышей или при наличии коморбидных состояний следует учитывать необходимость адаптации метода.
- Практические ограничения включают малый размер мишени, что требует корректировки координат в зависимости от линии животных, а также тщательного послеоперационного ухода для обеспечения выживаемости.
