Прикосновение Универсальный мышиной модели подкорковых белого вещества для изучения дегенерации аксонов и белого вещества нейробиологии

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы точно определить местоположение небольшого штриха в белом веществе мыши, чтобы смоделировать эту распространенную форму подкоркового инсульта белого вещества. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области инсульта, такие как механизмы повреждения аксонов, реакция нейронов на подкорковый инсульт и как клеточные элементы белого вещества реагируют как во время острой, так и в восстановительной фазы инсульта. Основное преимущество этой методики заключается в том, что с ее помощью можно точно локализовать мазок на белом веществе, а также можно использовать с самыми разными моделями мышей.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности из-за небольшого количества белого вещества, что приводит к неправильной локализации инсульта. Могут потребоваться незначительные корректировки угла инъекции или стереотаксических координат для каждой разновидности мыши, а также стереотаксическая настройка. Начните с прикрепления стеклянной пипетки к трубке, подключенной к вакуумной линии.

Вставьте вытянутый конец в раствор L-Nio или L-Nio plus флуоресцентный индикатор. Запустите вакуум и применяйте всасывание до тех пор, пока не будет заполнено не менее двух миллиметров от диаметра пипетки 0,5 мм. Отложите наполненную пипетку в сторону.

Затем поместите мышь в стереотаксический аппарат, оснащенный стереотаксическим микроскопом. После обезболивания и подготовки мыши к операции в соответствии с утвержденными процедурами проверьте глубину анестезии, ущипнув палец ноги. Ответа быть не должно.

Далее отрегулируйте руку впрыска на 36 градусов. Прикрепите держатель для дозатора из вытянутого стекла к дистальному концу системы впрыска под низким давлением и прикрепите его к кронштейну для впрыска. Сделав разрез по средней линии кожи головы на 1,5 сантиметра, чтобы обнажить череп, высушите поверхность черепа ватным тампоном.

Затем, глядя в стереотаксический микроскоп, при увеличении от одного до трех крат, используйте микроточечный инструмент для удаления любой вышележащей надкостничной ткани. Отметьте брегму тонким маркером. Затем с помощью хирургической дрели, оснащенной хирургическим сверлом с тонким наконечником, просверлит двухмиллиметровую эллиптическую трепанацию черепа, начинающуюся сзади на брегме и простирающуюся спереди чуть левее средней линии.

Удалите костные фрагменты и вышележащие мягкие ткани, чтобы можно было визуализировать кору головного мозга. Поддерживайте поверхность коры головного мозга во влажном состоянии, периодически нанося капли стерильного физиологического раствора. Затем прикрепите наполненную пипетку к кронштейну инжектора.

Совместите дистальный конец пипетки с брегмой и обнулите стереотаксические координаты. Переместите пипетку к первой точке инъекции, используя передние, задние и медиально-латеральные координаты, перечисленные в таблице 1. Затем переместите пипетку к поверхности коры головного мозга и обнулите дорсально-вентральное измерение.

Медленно опустите пипетку в дорсально-вентральные координаты. Убедитесь, что увеличение стереотаксического микроскопа установлено на три X и что откалиброванная сетка может быть четко видна. Просмотрите расположенную под углом пипетку сбоку, чтобы мениск воздушной жидкости имел сагиттальный обзор.

Мениск должен находиться в одной и той же фокальной плоскости как внутренней, так и внешней стенки пипетки. Теперь, используя систему локального впрыска давления, установленную на 20 фунтов на квадратный дюйм для 20 миллисекундных импульсов, введите в мозг 100 нанолитров L-Nio. После введения всего объема подождите пять минут, чтобы предотвратить обратный поток вверх по дорожке пипетки.

Затем извлеките пипетку и повторите процедуру инъекции по второму и третьему набору координат, приведенным в таблице 1. После заключительной инъекции извлеките пипетку и поместите достаточное количество костного воска, чтобы заполнить место трепанации черепа. Наконец, приблизьтесь к краям раны на коже головы и перевяжите дермальным клеем.

После введения послеоперационной анальгезии поместите животное в чистую клетку. Вводите послеоперационные антибиотики в питьевую воду в течение пяти дней или до жертвоприношения, если менее пяти дней. После жертвоприношения и обезглавливания мыши в соответствии с утвержденными процедурами с помощью стерильных ножниц вскройте череп сзади, а затем с помощью шпателя аккуратно удалите вышележащий череп.

Затем вставьте стерильный четырехмиллиметровый шпатель в переднюю часть мозга, чтобы разорвать обонятельную луковицу и зрительные нервы. Затем осторожно выньте мозг из кальвариума и поместите в ледяной буфер для вскрытия. Используя мозговой блок и стерильные бритвенные лезвия, отрежьте два-три миллиметра среза, содержащие пораженную область, и поместите в буфер для холодной диссекции.

Под рассекающим микроскопом определите белое вещество, лежащее под моторной корой головного мозга в инъецируемом полушарии. В более ранние интервалы после инсульта введение L-Nio в смеси с обычными лабораторными красителями, такими как быстрый зеленый, может обеспечить визуальную идентификацию инсульта. При более длительных интервалах после инсульта область может быть визуально идентифицирована по фокальному некрозу и миелиновой бледности.

После идентификации используйте скальпель, чтобы тщательно препарировать область белого вещества, содержащую штрих. При желании удалите вышележащую кору и нижележащее полосатое тело. Как показано здесь, иммунофлуоресцентное мечение нейронных филаментов, показанное красным цветом, демонстрирует степень потери аксонов через семь дней после инсульта с использованием медиального доступа.

При использовании заднеуглового доступа поражение белого вещества нацелено чуть выше латерального желудочка и демонстрирует интенсивную микроглиальную реактивность, что обнаруживается с помощью иммуномаркировки IBA-1. Два маркера промежуточных филаментов астроцитов, виментин, показанный красным цветом, и глиальный фибриллярный кислый белок, показанный зеленым, показывают изменения в морфологии астроцитов белого вещества после инсульта. Коинъекция флуоресцентного декстранамина в момент индукции инсульта позволяет идентифицировать отдельные нейроны с аксонами, поврежденными в результате инсульта.

Большая часть маркировки происходит в аксонах в пределах пятого и шестого слоев нейронов в первичной сенсомоторной коре, лежащей над инсультом. Это изображение представляет собой семь дней после инсульта. После освоения этой техники ее можно сделать за 45 минут, если она выполнена правильно.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как произвести фокальный удар белого вещества у мыши, и подготовить мозг к различным нисходящим процессам, полезным для ответа на важные вопросы в области инсульта и нейрорепарации.