Последовательное извлечение растворимых и нерастворимых Альфа-синуклеина из Паркинсона Brains

Общая цель данной методики заключается в извлечении растворимого и нерастворимого альфа-синуклеина из посмертного мозга при болезни Паркинсона. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в изучении болезни Паркинсона. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она представляет собой относительно простую методику с использованием обычных лабораторных реактивов и инструментов.

После приготовления необходимых растворов и буферов начните с помещения 0,5 грамма образца замороженной ткани базальных ганглиев на небольшую чашку Петри. С помощью стерильного лезвия скальпеля быстро измельчите на квадратный миллиметр фрагменты. Соберите измельченную ткань в пробирку объемом 15 миллилитров, и добавьте в пробирку 10 объемов ледяного масла 1X TBS.

Гомогенизируйте образцы с помощью механического гомогенизатора при 20 000 об/мин в течение 10 секунд. Затем остудите на льду две минуты. Повторите гомогенизацию три раза, каждый раз охлаждаясь на льду.

Центрифугируйте гомогенат при давлении 10 000 g в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите надосадочную жидкость из сырого гомогената в поликарбонатные центрифужные пробирки и центрифугируйте при давлении 100 000 g в течение одного часа при четырех градусах Цельсия. Перенесите надосадочную жидкость в охлажденные пробирки на льду и сохраните его в качестве растворимой фракции TBS.

Промойте в пяти объемах 1X TBS буфер и центрифугируйте при 100 000 г в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Отсадите и выбросьте надосадочную жидкость. Затем повторите стирку.

Тщательная промывка гранул между этапами ультрацентрифугирования имеет решающее значение для успеха этой процедуры. После того, как образцы нагреются до температуры 10 градусов Цельсия, чтобы избежать выпадения SDS, добавьте пять объемов 1X TBS-SDS и повторно суспендируйте последнюю гранулу путем ультразвуковой обработки в течение 10 секунд при 20 килогерц при комнатной температуре. Ультрацентрифуга при 100 000 g в течение 30 минут при 25 градусах Цельсия.

После ультрацентрифугирования надосадочную жидкость переложить в охлажденные пробирки на льду и сохранить в качестве растворимой фракции SDS. Добавьте в гранулу пять объемов буфера комнатной температуры 1X TBS-SDS и центрифугируйте при 100 000 г в течение 15 минут при температуре 25 градусов Цельсия. Выбросьте буфер для стирки и повторите стирку.

После сброса надосадочной жидкости добавьте 50 микролитров 1X TBS-SDS-Urea и солюбилизируйте с помощью набора ультразвуковых аппаратов на частоте 20 килогерц в течение 10 секунд. Пометьте этот образец как растворимая в мочевине фракция. Важно тщательно убедиться, что все нерастворимые белки экстрагируются во время процедуры.

Разбавляйте образцы TBS-SDS-мочевины один к одному буфером 1X TBS для обеспечения совместимости с реагентами для анализа белка и анализируйте каждую фракцию на общее содержание белка с помощью коммерческого набора для анализа белка в соответствии с протоколом производителя. Возьмите образцы аликвот в 20 микролитров с 10% глицерина для сокращения будущих циклов замораживания-оттаивания и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия. Загрузите 10 микролитров экстрактов TBS, TBS-SDS и TBS-SDS-мочевины в маркер молекулярной массы на 10 лунок, от четырех до 12 процентов полиакриламидного геля Bis-Tris с MOPS в качестве буфера для работы с использованием стандартных методов.

Запустите гель при напряжении 200 вольт в течение одного часа или до тех пор, пока синий краситель из буфера загрузки не достигнет дна геля. Намочите нейлоновую мембрану в 100% метаноле, а затем замочите в буфере для переноса, содержащем 20% метанола. Сделайте опознавательную отметку на блоте, чтобы определить сторону белка и ориентацию маркеров размера молекулярной массы.

Скрепите гель мембраной рядом с влажной фильтровальной бумагой. Выполняйте перенос в течение двух часов при напряжении 40 вольт. Блокируйте раствор в 5% BSA в 1X PBS-T на 30 минут встряхиванием при 70 об/мин для предотвращения неспецифического связывания первичного антитела с мембраной.

Зондируйте белковый блоттинг путем инкубации с шестью миллилитрами альфа-синуклеина первичного антитела Syn-1, разведенного от одного до 750 в PBS-T в течение ночи при четырех градусах Цельсия. На следующий день промойте мембрану 1X PBS-T три раза по пять минут каждый раз. Затем инкубируют блот с соответствующими конъюгированными HRP вторичными антителами, разведенными от одного до 2000 в PBS-T в течение 30 минут.

Промойте мембрану, как и раньше, с помощью 1X PBS-T. Погрузите кляксы в усиленный раствор хемилюминесценции согласно инструкции производителя в темное помещение. Накройте кляксы пищевой пленкой, а сигнал зафиксируйте с помощью авторадиографии.

После визуализации инкубируйте вестерн-блот с шестью миллилитрами буфера для стриппинга вестерн-блоттинга в течение 10 минут с постоянным встряхиванием, чтобы лишить блоттинг сигнала антител альфа-синуклеина. Повторите процедуру вестерн-блоттинга для зондирования мембраны первичным бета-актиновым антителом в разведении от 1 до 8000. Отсканируйте и преобразуйте итоговое изображение в изображение в формате Tiff и измерьте плотность с помощью NIH ImageJ для количественного анализа.

Следующие изображения являются репрезентативными иммуноблотами альфа-синуклеина из БП и контролируют ткань базальных ганглиев человека. Растворимые фракции TBS, SDS и мочевины были проанализированы на наличие альфа-синуклеина с использованием западного иммуноблоттинга. В каждую дорожку загружалось по 10 миллиграммов белка.

Во фракции ТБС во всех случаях присутствуют мономера альфа-синуклеина. Звездочка, возможно, представляет собой С-терминально усеченную форму альфа-синуклеина. Во фракции SDS некоторые олигомеры альфа-синуклеина наблюдаются вместе с мономерами, на что указывает твердый стреловидный наконечник в ткани PD.

Во фракции мочевины мономеры, олигомеры и агрегированный альфа-синуклеин по-разному экспрессируются в случаях БП, отражая их соответствующую нагрузку телец Леви. Неврологически нормальные контрольные образцы показывают присутствие лишь небольших количеств мономерного альфа-синуклеина. После освоения этого метода экстракции белка его можно проводить в течение рабочего дня, а на следующий день — вестерн-иммуноблоттинг, если он выполнен правильно.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биологии телец Леви к изучению нерастворимых и агрегированных видов альфа-синуклеина в патологических тканях человека и на животных моделях in vivo. Не забывайте, что работа с незафиксированными человеческими тканями требует мер предосторожности, а также для всех процедур обработки следует надевать перчатки и лабораторные халаты.