В режиме реального времени изображений растений клеточной поверхности динамика с переменным углом эпифлуоресцентной микроскопии

Общая цель этой процедуры заключается в наблюдении за движением флуоресцентно меченых белков на поверхности растительных клеток с помощью эпифлуоресцентной микроскопии с переменным углом. Этот сосуд может помочь нам продвинуться в области биологии растительных клеток, например, в том, как белок работает на поверхности клеток пластин. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет нам визуализировать динамику флуоресцентных атакующих белков в режиме реального времени перед началом процедуры.

Откалибруйте лазерное центрирование и фокусировку микроскопа в соответствии с инструкциями производителя. Затем используйте свободный световой путь объектива, чтобы найти центр потолка комнаты для микроскопии и отметить положение цветным уплотнением. Далее подсветите потолок линзой объектива и переместите освещенную область в центральное положение.

Затем сфокусируйте лазер и точно настройте положение лазера по центру потолка. Центрирование и фокусировка лазера очень важны для успешного наблюдения эпиароматическим микроскопом с переменным углом наклона или наблюдением VAEM. Перед началом эксперимента пользователи должны быть обучены профессиональным сотрудником компании, производящей микроскопы.

Когда микроскоп будет готов, нанесите 30 микролитров базального буфера на центр предметного стекла размером 76 на 26 миллиметров. Затем с помощью ножниц для препарирования удалите свинец из семидневного саженца и поместите свинец стороной наблюдения вверх на базальную буферную каплю. Далее добавьте 30 микролитров базального буфера в центр размером 18 на 18 миллиметров.

Накройте стекло и переверните покровное стекло вверх дном. Мягкое поверхностное натяжение предотвратит попадание капли, удерживая покровное стекло пинцетом за один край. Поместите противоположный край на предметное стекло так, чтобы буфер находился над подводным

Затем держа край покровного стекла на предметном стекле. Отрегулируйте положение капли так, чтобы она находилась прямо над образцом олеина, и опустите покровное стекло. Если пузырьков воздуха нет, используйте безворсовые салфетки, чтобы стереть излишки буфера и сразу же перенесите препарат в микроскоп.

Используя светлопольную подсветку, выделите ячейки для наблюдения. Затем убедитесь, что флуоресцентный белок можно наблюдать, и используйте эпифлуоресцентное освещение для установки положения оси Z на поверхности клетки. Для выполнения VAEM используйте блок контроллера для наклона угла входа лазерного луча.

Постепенно, при этом внимательно следя за живым изображением. Первоначально изображение будет выглядеть размытым. По мере увеличения угла лазерного излучения изображение VAEM становится менее размытым, что в конечном итоге дает четкое изображение.

На этом этапе прекратите увеличивать угол наклона лазера. Теперь хорошо. Настройте угол входа лазера для получения лучшего изображения, регулируя параметры оптической системы и датчика изображения по мере необходимости.

Затем с помощью коммерческого программного обеспечения для микроскопа получите фильм в виде многостраничного файла изображения в формате TIFF. Здесь в фильме показаны точки, помеченные GFP, мигающие на поверхности ячеек модели STA. Чтобы количественно оценить время проживания с меткой GFP DOT с использованием Фиджи, перейдите в меню открытия файла и откройте полученный многостраничный файл советов.

Используйте инструмент выделения прямой линии, чтобы разместить линию на интересующей стороне. Затем используйте плагин динамического среза изображения стеков изображений для создания графического изображения. По мере изменения линии изображение графика будет изменяться динамически.

Сохраните изображение в виде файла TIFF под файлом, сохраните в меню tiff. Затем для выполнения шумоподавления перейдите в меню фильтра фильтра по Гауссу и примените фильтр Гаусса к изображениям хронографа. Параметр радиуса сигма должен быть настроен по мере необходимости.

С помощью инструмента настройки порога изображения сегментируйте области сигнала по пороговому значению и откройте меню анализа измерений. Далее проверьте ограничивающий прямоугольник в окне набора измерений, выбрав минимально возможное количество пикселей. Затем в меню «Анализировать, анализировать частицы».

Измерьте время нахождения интересующей точки относительно оси Y, проверьте результаты отображения и добавьте в поля менеджера для просмотра значений данных. Наконец, в меню таблицы результатов выберите «Файл», «Сохранить как и обработать набор данных о длительности точечных изображений» с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа. Здесь показано время пребывания 185 GFP в патрулировании в одной точке от 12 независимых вспомогательных ячеек в восьмом эдине, измеренное с помощью анализа графика CHM, как показано на графике.

Функция подогнанной плотности показала, что большинство патрульных точек GFP находились во вспомогательной ячейке от двух до 10 секунд с пиком около 3,5 секунд. Это позволяет предположить быстрый экзоцитозный эндоцитоз протонных насосов на вспомогательной поверхности клетки. После работы с этим видео у вас должно быть хорошее понимание того, как визуализировать и количественно оценить динамику белков арного типа на поверхности растительных клеток с помощью эпифлуоресцентной микроскопии с переменным углом.