В режиме реального времени изображений растений клеточной поверхности динамика с переменным углом эпифлуоресцентной микроскопии

Общая цель данной процедуры заключается в наблюдении за перемещением белков с флуоресцентными метками на поверхности растительных клеток с помощью эпифлуоресцентной микроскопии с переменным углом. Данный метод может способствовать развитию клеточной биологии растений, например, в изучении механизмов работы белков на поверхности растительных клеток. Основным преимуществом этого метода является возможность визуализации динамики белков с флуоресцентными метками в режиме реального времени перед началом процедуры.

Откалибруйте центрировку и фокусировку лазера микроскопа в соответствии с инструкциями производителя. Затем с помощью свободного оптического пути объектива определите центр потолка помещения для микроскопии и отметьте это место цветным маркером. После этого осветите потолок с помощью объектива и переместите освещенную область в центральное положение.

Затем сфокусируйте лазер и точно настройте его положение по центру потолка. Центрирование и фокусировка лазера крайне важны для успешного наблюдения с помощью эписцентного микроскопа с переменным углом (VAEM). Перед началом эксперимента пользователи должны пройти обучение у квалифицированного специалиста компании-производителя микроскопа.

Когда микроскоп будет готов, нанесите 30 µL базального буфера в центр предметного стекла размером 76 на 26 мм. Затем с помощью диссекционных ножниц удалите корешок из семидневного проростка и поместите его стороной для наблюдения вверх в каплю базального буфера. Далее нанесите 30 µL базального буфера в центр покровного стекла размером 18 на 18 мм.

Накройте покровным стеклом и переверните его. Осторожно придерживая покровное стекло пинцетом за один край, используйте силу поверхностного натяжения, чтобы капля не стекла. Опустите противоположный край на предметное стекло так, чтобы буфер оказался над направляющим участком.

Затем, удерживая край покровного стекла на предметном стекле, отрегулируйте положение капли так, чтобы она находилась непосредственно над образцом олеина, и опустите покровное стекло. При отсутствии пузырьков воздуха удалите излишки буфера безворсовой салфеткой и немедленно перенесите препарат под микроскоп.

Используя освещение в светлом поле, выберите клетки для наблюдения. Затем убедитесь, что флуоресцентный белок визуализируется, и с помощью эпифлуоресцентного освещения установите положение по оси Z на поверхности клетки. Для проведения VAEM используйте блок управления, чтобы изменить угол входа лазерного луча.

Постепенно, внимательно наблюдая за изображением в режиме реального времени. Сначала изображение будет выглядеть размытым. По мере увеличения угла лазера изображение VAEM будет становиться менее размытым, пока в итоге не получится четкое изображение.

На этом этапе прекратите увеличение угла наклона лазера. Теперь выполните точную настройку угла входа лазерного луча для получения более качественного изображения, при необходимости корректируя параметры оптики и датчика изображения.

Затем с помощью коммерческого программного обеспечения микроскопа запишите видео в виде многостраничного TIFF-файла. На данном видео видны мигающие точки, меченные GFP, на поверхности клеток модели STA. Чтобы количественно определить время пребывания точек, меченных GFP, с помощью Fiji, перейдите в меню открытия файлов и откройте полученный многостраничный TIFF-файл.

Используйте инструмент выделения прямой линией, чтобы провести линию вдоль интересующего участка. Затем используйте плагин dynamic res slice для стеков изображений, чтобы построить график. При перемещении линии график будет изменяться динамически.

Сохраните изображение в формате TIFF через меню «Файл» > «Сохранить как TIFF». Затем для снижения уровня шума перейдите в меню «Процесс» > «Фильтры» > «Размытие по Гауссу» и примените фильтр Гаусса к изображениям хронографа. Параметр радиуса сигма следует настроить по мере необходимости.

С помощью инструмента регулировки порога изображения (image adjust threshold tool) сегментируйте области сигнала путем пороговой обработки и откройте меню настройки измерений (set measurements). Затем в окне настройки измерений отметьте пункт «ограничивающий прямоугольник» (bounding rectangle), выбрав минимально возможное количество пикселей. После этого перейдите в меню «Анализ» (analyze) → «Анализ частиц» (analyze particles).

Измерьте время интересующей точки по оси Y, проверьте полученные результаты и добавьте их в окна менеджера для просмотра значений данных. Наконец, в меню таблицы результатов выберите «файл» (file), затем «сохранить как» (save as) и обработайте набор данных о длительности точек изображения с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа. Здесь, как показано на графике, представлены времена пребывания 185 точек GFP patrol one из 12 независимых дочерних клеток в восьмом edi, измеренные с помощью анализа chm graph.

Аппроксимированная функция плотности показала, что большинство точек GFP patrol one находились в вспомогательной клетке в течение от 2 до 10 секунд с пиком около 3,5 секунд. Это указывает на быстрый цикл экзоцитоза-эндоцитоза протонных насосов на поверхности вспомогательной клетки. После изучения данного видео вы должны хорошо понимать, как визуализировать и количественно оценивать динамику белков любого типа на поверхности растительной клетки с помощью эпифлуоресцентной микроскопии с переменным углом.