Мультиплекс Обнаружение бактерий в сложных клинических и экологических пробах с использованием олигонуклеотидных связью Флуоресцентные Микросферы

Здравствуйте, меня зовут Тим Дусо из Министерства сельского хозяйства и продовольствия Канады. В этом видео мы продемонстрируем протокол определения присутствия и обилия конкретных микроорганизмов в сложном клиническом образце или образце окружающей среды с помощью прибора bioplex. В этом протоколе используются флуоресцентные полистирольные шарики, которые химически связаны с видоспецифичным олигонуклеотидным зондом.

Ампликон получают из образца с помощью универсальных праймеров для ПЦР, а ампликон гибридизуют с шариками, связанными зондом. С помощью прибора bioplex генерируются два сигнала. Один идентифицирует бусину, а другой количественно определяет сигнал гибридизации.

Общая цель процедуры заключается в быстром и полуколичественном определении профиля интересующей микробиоты. Мы применили этот метод для определения бактериальных профилей в мазках из влагалища и используем полученные данные для диагностики бактериального вагиноза — клинического состояния, которое характеризуется изменением микробиоты, при котором организмы лактобактерий становятся менее распространенными, а другие организмы, такие как гарднерелла, ваис и апоян, становятся обнаруживаемыми в мазках из влагалища. Однако важно помнить, что этот метод может быть применен к любой другой микробиоте, для которой желателен быстрый мультиплексный анализ.

Давайте начнем с описания того, как работает процедура. Микробный профиль создается путем амплификации белка и покрытия гена шаперона в 60 из всех организмов, присутствующих в экстракте ДНК мазка. Один из универсальных амплификационных праймеров модифицирован добавлением биотина, а также включением фосфоатированных модифицированных оснований.

На пятом простом конце ампликон делается одноцепочечным с использованием нуклеазы Т-семи экзонов, которая разрушает только антисмысловую цепь. Поскольку чувствительная цепь защищена фосфонато-модифицированным ПЦР-праймером, олигонуклеотидные зонды, комплементарные оставшейся цепи, ковалентно связаны с флуоресцентными полистирольными шариками. Поскольку каждая бусина уникального цвета содержит зонд, обнаруживающий отдельный организм, для одного образца можно использовать до ста различных бусин.

Одноцепочечный продукт ПЦР из вагинального тампона гибридизуют со смесью шариков, связанной зондом, содержащей зонды для всех интересующих организмов. Добавляется флуоресцентный репортер FICO этин, который связывается с биотинилированными зондами через стрептококковый конъюгат. Наконец, гибридизационную смесь анализируют на приборе luminex или bioplex, который исследует каждую бусину по отдельности на предмет идентичности и сигнала гибридизации.

Результаты этого анализа указывают на наличие специфических микроорганизмов, а интенсивность сигнала гибридизации коррелирует с численностью этого организма. В образце наличие микроорганизмов, связанных с БВ, может быть использовано для диагностики БВ. Главное преимущество данной методики перед существующими методами вроде большого окрашивания, заключается в том, что вырабатывается информация о наличии конкретных микроорганизмов и их численности.

Демонстрировать эту процедуру будет Дженнифер Таун (Jennifer Town), научный сотрудник нашей лаборатории, которая суспендирует микросферы путем вихревого движения примерно на 20 секунд. Перенесите 400 микролитров микросфер в центрифугу с пробиркой Эйнора при 14 000 G на одну минуту, удалите и выбросьте Snat Resus. Суспендируйте микросферы в 50 микролитрах 0,1 моляра MES pH 4,5.

Добавьте к микросферам по одному аниме олиго захвата и перемешайте путем вортексирования. Добавьте к микросферам 2,5 микролитра свежего раствора EDC. Инкубируйте реакцию при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте.

Выбросьте раствор EDC, который был приготовлен ранее, и приготовьте свежий образец 10 миллиграммов на миллилитр EDC в воде. Как и выше, добавьте к микросферам еще 2,5 микролитра свежего раствора EDC и перемешайте на пять секунд. Снова инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте.

Промойте шарики, добавив один миллилитр 0,02%Tween 20 vortex, чтобы повторно суспендировать шарики центрифуги при 14 000 G. В течение одной минуты удалите и выбросьте надосадочную жидкость. Промойте бусины еще раз, добавив один миллилитр 0,1% SDS Resus. Суспензируйте шарики в 100 микролитрах te буфера.

Перечислите бусины в гемоцитометре для определения концентрации бусин. Приготовьте мастер-смесь для микросфер, разбавив каждую бусину до конечной концентрации 100 бусин на микролитр в буферной пуле спаренных бусин в соответствии с желаемым набором пробы. Храните мастер-смесь микросфер при четырех градусах в темноте. Эта смесь может храниться месяцами, если хранить в этих условиях, генерировать продукт ПЦР для каждого образца.

Включите набор фосфолатов и модифицированных биотином пяти праймеров сразу после завершения ПЦР. Добавьте по два микролитра Т7 экзонуклеазы в каждую ПЦР-пробирку, инкубируйте при комнатной температуре в течение 40 минут. В конце этой инкубации добавьте 12,5 микролитров 0,5 моляра E-D-T-A-P-H 8,0 в смесь.

Это дает в общей сложности около 64,5 микролитров одноцепочечного ПЦР-продукта. Мастер-микс Resus Bend Microsphere с помощью пипетки. Налейте нужное количество в пробирку эйнора.

Закройте трубку крышкой и окунитесь ультразвуком на водяной бане в течение двух минут. Диспонируйте 17 микролитров одноцепочечного ПЦР-продукта в соответствующие лунки с низким профилем 96. В лунку планшета добавьте 33 микролитра смеси ресуспендированных ультразвуковых шариков в каждую.

Хорошо накройте тарелку силиконовым чехлом и постукивайте. Аккуратно поставьте тарелку в термоамплификатор с программой 95 градусов на пять минут, 60 градусов на 10 минут, 60 градусов держите или делайте паузу 60 градусов на пять минут. Закончите, запустите программу.

Приготовьте свежий стрептококк Аден FICO Ethin раствором. Вам понадобится 25 микролитров на лунку. Изготовьте стрептококк и этин FICO, разведя плодоножку на один миллиграмм на миллилитр.

Один из 50-20 микрограммов на миллилитр с одним tmac буфером. Когда термоамплификатор дойдет до шага удержания 60 градусов, откройте крышку, снимите силиконовую крышку и добавьте раствор этина strep din FICO непосредственно в каждую. Ну и установите на место силиконовую крышку, закройте крышку термоамплификатора и возобновите программу.

Когда программа будет завершена, выньте пластину и быстро перенесите ее в аппарат bioplex для считывания. Табличка должна быть прочитана в течение 10 минут. Читайте на табличке под углом 60 градусов.

Убедитесь, что биоплекс был предварительно прогрет до этой температуры. Он показывает результаты соответствующих пятен по Граму и профилей люминекса продольных образцов от одного индивидуума в нулевой момент времени. Окрашивание по Граму согласуется с клиническим диагнозом bv, и это подтверждается анализом Fiveplex Luminex, который показывает положительные сигналы гибридизации для организмов, ассоциированных с BV, включая Gardner Relic, vais и Apoian Vae.

Lactobacillus Iners также обнаруживается на низких уровнях с течением времени. Этот человек переходит от микробиоты BV к нормальной микробиоте, о чем свидетельствуют окрашивания по Граму. Анализ этих же образцов показывает, что численность Gardnerella vaginalis достигает пика и уменьшается, в то время как lactobacillus iners увеличивается, становясь доминирующим организмом к окончательному моменту времени.

С помощью этого метода для профилирования микробиоты формируется информация о наличии конкретных организмов, а также об их численности. Поскольку метод основан на последовательности, дизайн зонда может быть основан на глубоком анализе секвенирования, а микроорганизмы, идентифицированные методами секвенирования следующего поколения, могут быть отслежены в образцах быстрым и относительно недорогим способом. Просмотр этого видео должен был дать вам хорошее понимание того, как создать микробный профиль из образца с помощью прибора Luminex или Bio Plex.

Мы показали вам, как соединить олигонуклеотидные зонды с флуоресцентными шариками, получить одноцепочечный аликон из клинического образца или образца окружающей среды, выполнить гибридизацию и определить результаты с помощью прибора Luminex или Bio Plex. Удачи в ваших экспериментах.