Быстрый и эффективный метод для очистки эндодермы клеток, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека

Общая цель данного метода заключается в очистке эндодермальных клеток, полученных из эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области стволовых клеток, касающиеся дифференцировки эндодермы. Основным преимуществом данной методики является возможность получения чистой популяции эндодермальных клеток после удаления недифференцированных клеток.

Перед началом процедуры покройте шесть лунок планшета для культивирования клеток одним миллилитром матрикса базальной мембраны на лунку. Выдержите не менее 30 минут при комнатной температуре. Затем, для сбора человеческих ЭСК, аспирируйте среду из культуры эмбриональных стволовых клеток человека с конфлюэнтностью 80–90% с помощью стерильной стеклянной пипетки Пастера.

Промойте клетки, добавив по 2 мл PBS в каждую лунку. Встряхните планшет и аспирируйте физраствор, чтобы удалить погибшие клетки и клеточный детрит. Затем осторожно диссоциируйте клеточные кластеры, добавив 1 мл реагента — раствора для пассирования без ферментов, при температуре 37 °C и 5% CO2, до появления явных признаков распада клеток на более мелкие кластеры.

Примерно через семь минут добавьте в лунки один миллилитр среды DMMF12. Несколько раз перемешайте содержимое, используя наконечник дозатора на один миллилитр, чтобы перевести оставшиеся клеточные агрегаты в суспензию одиночных клеток. С помощью того же дозатора перенесите клетки в центрифужную пробирку и промойте лунки одним миллилитром свежей среды DMMF12, собирая промывочную жидкость в пробирку.

После центрифугирования ресуспендируйте осадок в пяти миллилитрах среды для культивирования ЭСК с добавлением ингибитора ROCK. Подсчитайте количество клеток и высейте 1,5–4 × 10⁵ клеток на лунку на планшеты, покрытые матриксом базальной мембраны, в культуральной среде с добавлением ингибитора ROCK для предотвращения апоптоза. Инкубируйте клетки примерно в течение 24 часов.

Затем с помощью стерильной стеклянной пастеровской пипетки замените среду в каждой лунке на 2 milliliters среды для индукции примитивной полоски. После еще 24 часов культивирования замените среду на среду для индукции энтодермы и инкубируйте клетки в течение 48 часов, ежедневно меняя среду. В последний день культивирования, как минимум за один час до сбора клеток, добавьте в культуральную среду свежий ингибитор ROCK.

Затем с помощью стерильной стеклянной пастернаж-пипетки аспирируйте среду из каждой лунки и диссоциируйте клетки, используя реагент раствора для пассирования без содержания ферментов, как было показано ранее. После получения суспензии из отдельных клеток подсчитайте их количество и центрифугируйте. Убедитесь, что с этого момента во все среды и буферы добавлен ингибитор ROCK, чтобы предотвратить гибель клеток.

В противном случае после отхождения они не прикрепятся должным образом. Ресуспендируйте осадок в 100 µL буфера PEB, дополненного ингибитором ROCK в расчете на 1 × 10⁷ клеток. Затем добавьте к клеткам антитела к CXCR4, конъюгированные с APC.

Осторожно постучите по пробирке, чтобы перемешать содержимое. Через 15 минут выдержки при температуре 4 °C промойте клетки в 1–2 миллилитрах буфера PEB и с помощью стерильной стеклянной пастеровской пипетки аспирируйте супернатант. Ресуспендируйте осадок в 80 мкл буфера PEB на 1 × 10⁷ клеток и добавьте к клеткам 20 мкл анти-APC микросфер.

Перемешайте образец легкими постукиваниями. Затем инкубируйте клетки при температуре 4 °C в течение 15 минут. По окончании инкубации промойте клетки 1–2 мл буфера PEB с добавлением ингибитора ROCK.

Затем ресуспендируйте осадок в 500 µL свежего буфера PEB с ингибитором. Чтобы изолировать клетки CXCR4+ методом магнитного сепарирования, установите магнитную колонку среднего размера на соответствующий магнит и предварительно промойте колонку 500 µL буфера PEB с ROCK-ингибитором. Когда весь промывочный раствор стечет с верхней части колонки, внесите в нее весь объем клеток, меченных магнитными частицами, собирая протекающую фракцию в коническую пробирку.

Промойте колонку трижды, используя по 500 µL буфера PEB с ингибитором ROCK. Затем перенесите колонку с магнита в подходящую пробирку для сбора. Пропустите 1 mL буфера PEB с ингибитором ROCK через колонку, чтобы собрать клетки CXCR4+.

При необходимости все образцы проскока можно собрать по отдельности, а аликвоты по 20 microliter из каждого образца использовать для определения процента CXCR4+клеток в каждой аликвоте методом проточной цитометрии. Эту процедуру можно повторить с первым проскоком для сбора клеток, которые не связались с колонкой. Затем объедините все аликвоты с CXCR4+клетками и центрифугируйте их.

Наконец, ресуспендируйте осадок в одном миллилитре среды для индукции эндодермы с добавлением ингибитора ROCK и посейте клетки с подходящей плотностью в контейнер для культивирования клеток, покрытый матриксом базальной мембраны. До начала дифференцировки эмбриональные стволовые клетки человека экспрессируют высокие уровни маркера плюрипотентности SOX2, в то время как маркер дефинитивного эндодермального слоя FOXA2 не обнаруживается.

При дифференцировке ЭСК претерпевают резкие изменения в экспрессии генов и белков. Действительно, через четыре дня пребывания в дифференцировочной среде SOX17 и FOXA2均 ко-экспрессируются равномерно в ядрах многих бывших ЭСК, что является признаком commitment (предопределенности) к дефинитивному энтодерме. Некоторые клетки сопротивляются процессу дифференцировки, не экспрессируя ни один из двух маркерных белков.

И фактически, они сохраняют экспрессию маркера плюрипотентности SOX2. В данном репрезентативном эксперименте на третий день дифференцировки почти 60% собранных ЭСК экспрессировали CXCR4, при этом чистота популяции была увеличена до более чем 85% после магнитной сортировки плюрипотентных и других нежелательных клеток линий. После посева очищенных клеток CXCR4+ обнаруживается лишь несколько клеток SOX2+, при этом большинство посеянных клеток экспрессируют FOXA2.

При должном освоении эта методика может быть выполнена в течение двух часов, при условии правильного соблюдения всех этапов. После данной процедуры для получения дополнительных ответов о процессе дифференцировки можно провести другие исследования, такие как иммуногистохимический анализ или количественная ПЦР. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как очищать клетки энтодермы с помощью магнитной сортировки с использованием микросфер.