Быстрый и эффективный метод для очистки эндодермы клеток, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека

Общая цель этого метода заключается в очистке эндодермальных клеток, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека или ES-клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области стволовых клеток об эндодермальной дифференцировке. Основное преимущество этой методики заключается в том, что после удаления недифференцированных клеток можно получить чистую популяцию клеток энтодермы.

Перед началом процедуры покройте шесть луночных планшетов для клеточных культур одним миллилитром матрицы базальной мембраны на лунку. Не менее 30 минут при комнатной температуре. Затем, чтобы получить человеческие ES-клетки, отсасывайте среду из 80-90% сливающейся культуры эмбриональных стволовых клеток человека с помощью стерильной стеклянной пипетки Pasture.

И промойте клетки двумя миллилитрами PBS на лунку. Встряхните пластину и аспирируйте физиологический раствор, чтобы удалить мертвые клетки и мусор. Затем аккуратно диссоциируйте клеточные кластеры с помощью одного миллилитра реагента, не содержащего ферментов, при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, пока клетки не проявят явные признаки разрушения на более мелкие кластеры.

Примерно через семь минут добавьте в лунки один миллилитр среды DMMF12. И сделайте пипетку вверх и вниз несколько раз с помощью наконечника для дозатора объемом в один миллилитр, чтобы отделить оставшиеся клеточные агрегаты в одноклеточную суспензию. С помощью той же пипетки переложите клетки в центрифужную пробирку и промойте лунки одним миллилитром свежей среды DMMF12, собрав смывки в пробирке.

После вращения клеток повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах среды для культивирования клеток ES с добавлением ингибитора ROCK. Подсчитайте клетки и затравку в соотношении 1,5:4 умножить на 10 до пятой клетки в лунку на матриксном покрытии базальной мембраны в культуральной среде с добавлением ингибитора ROCK для предотвращения апоптоза. Инкубируйте клетки в течение примерно 24 часов.

А затем с помощью стерильной стеклянной пастеровской пипетки замените среду в каждой лунке на 2 миллилитра примитивной индукционной среды. После еще 24 часов культивирования замените среду средой для индукции энтодермы на 48-часовую инкубацию с ежедневной сменой среды. В последний день культивирования и не менее чем за час до забора клеток добавьте в питательную среду свежий ингибитор ROCK.

Затем используйте стерильную стеклянную пипетку Пастера для аспирации среды из каждой лунки и диссоциации клеток с помощью реагента для пропускания без ферментов, как показано выше. Когда будет получена суспензия одиночных клеток, подсчитайте клетки и центрифугируйте их. Убедитесь, что с этого момента все среды и буферы содержат ингибитор ROCK, чтобы предотвратить гибель клеток.

В противном случае они не будут прикреплены должным образом после отступления. Повторно суспендировать гранулу в 100 микролитрах буфера PEB, дополненного ингибитором ROCK, на 1 умножить на 10 до седьмой клетки. Затем добавьте в клетки антитело CXCR4 APC.

Аккуратно перелистывайте тюбик для перемешивания. Через 15 минут при температуре 4 градуса Цельсия промойте клетки в одном-двух миллилитрах буфера PEB и используйте стерильную стеклянную пипетку Пастера для аспирации надосадочной жидкости. Повторно суспендируйте гранулу в 80 микролитрах буфера PEB на 1 умножить на 10 до седьмой клетки и добавьте в клетки 20 микролитров микрогранул анти-APC.

Перемешайте образец легкими движениями. Затем инкубируйте клетки при температуре четыре градуса Цельсия в течение 15 минут. В конце инкубации промойте клетки одним-двумя миллилитрами буфера PEB с добавлением ингибитора ROCK.

И повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах свежего буфера PEB плюс ингибитор. Чтобы изолировать элементы CXCR4+ с помощью магнитного разделения, загрузите магнитную колонку среднего размера на магнит соответствующего размера и предварительно промойте колонку 500 микролитрами буфера PEB плюс ингибитор ROCK. Когда вся промывка стечет с верхней части колонны, нанесите на колонку весь объем магнитной маркировки ячейки, собирая поток в коническую трубку.

Промойте колонку с помощью трех применений 500 микролитров буфера PEB плюс ингибитор ROCK. Затем переложите колонку с магнита в подходящую сборную трубку. И пропустите один миллилитр буфера PEB плюс ингибитор ROCK через колонку, чтобы собрать клетки CXCR4+.

По желанию, все проточные образцы могут быть собраны отдельно, и 20 микролитров аликвот из каждого образца могут быть использованы для определения процентного содержания CXCR4+ клеток в каждом алуэте с помощью проточной цитометрии. Эту процедуру можно повторить с первым сквозным протоком, чтобы собрать клетки, которые не привязались к столбцу. Затем объедините оба выделенных образца CXCR4+ и центрифугируйте их.

Наконец, повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре индукционной среды для энтодермы, дополненной ингибитором ROCK, и засейте клетки с соответствующей плотностью в контейнер для клеточных культур, покрытый базальной мембраной. До своей дифференцировки ЭС-клетки человека экспрессируют высокие уровни маркера плюрипотентности SOX2. В то время как окончательный маркер энтодермы, FOXA2, не обнаруживается.

При дифференцировке ES-клетки претерпевают радикальные изменения в экспрессии генов и белков. Действительно, после четырех дней в среде для дифференцировки SOX17 и FOXA2 равномерно экспрессируются в ядрах многих бывших ES-клеток, что является отличительной чертой окончательной приверженности энтодерме. Некоторые клетки сопротивляются процессу дифференцировки, не экспрессируя ни один из двух маркерных белков.

И на самом деле, сохраняют свой маркер плюрипотентности SOX2 экспрессия. В этом репрезентативном эксперименте, на третий день дифференцировки, почти 60% собранных ЭС-клеток экспрессировали CXCR4, чистота которого была увеличена до более чем 85% после магнитной сортировки плюрипотентных и других нежелательных клеток линии. После посева очищенных клеток CXCR4+ обнаруживается только несколько SOX2+клеток, причем большинство засеянных клеток экспрессируют FOXA2.

После освоения этой техники она может быть завершена в течение двух часов, если она выполнена правильно. После этой процедуры могут быть выполнены другие, такие как иммунная гистохимия или КПЦР, чтобы ответить на дополнительные вопросы о процессе дифференцировки. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как очистить клетки энтодермы с помощью магнитной сортировки шариков.