HSV-опосредованной Transgene экспрессия химерных конструктов для изучения поведенческой Функция GPCR гетеромеров у мышей

Общая цель этого метода состоит в том, чтобы наблюдать, как вирус-опосредованный перенос генов влияет на поведенческие фенотипы, требующие гетеродимеризации рецепторов, сопряженных с G-белком, в мышиных моделях. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейро- и психофармакологии. В частности, как рецепторы, сопряженные с g-белком, взаимодействуют друг с другом на молекулярном уровне.

Используя этот метод, мы можем понять, как это взаимодействие влияет на поведение в моделях психических расстройств, таких как шизофрения и депрессия. Используя этот метод, мы собираемся конкретно рассмотреть сератонин 2а и метаботропный глутаматный рецептор 2, оба из которых, как было показано, участвуют в механизме действия лекарств, используемых для лечения пациентов с шизофренией. Начните с правильной анестезии мыши в соответствии с утвержденными методами.

Убедитесь, что была получена хирургическая плоскость анестезии, выполнив щипление пальца ноги и отметив отсутствие ответа. Затем нанесите офтальмологический гель для защиты глаз. Прикрепите мышь к стереотаксической рамке, обязательно отрегулировав наклон головы так, чтобы череп был ровным и плоским.

Нанесите повидон-йод на открытую кожу головы. С помощью скальпеля сделайте сагиттальный разрез по средней линии черепа в пределах обнаженной бритой области. Затем прикрепите зажимы для пюрита к коже в месте разреза, чтобы убедиться, что череп остается открытым.

Нанесите перекись водорода, чтобы растворить надкостницу и обнажить швы черепа. Теперь, когда брегма и швы видны, обязательно отрегулируйте стереотаксическую рамку, чтобы убедиться, что череп находится на одном уровне. Совместите кончики игл шприцев с брегмой и запишите координаты брегмы.

Для двустороннего введения в лобную кору прибавьте 1,6 мм к зарегистрированной координате ростральной каудальной брегмы и 2,6 мм к зарегистрированной медиальной латеральной координате брегмы. Отметьте места инъекций на черепе, а затем просверлите небольшие отверстия в местах инъекций. С помощью аппликатора с ватным наконечником сотрите лишнюю кровь или костные фрагменты.

Поднесите иглу к поверхности мозга, и опустите на глубину дорсальной вентральной координаты. Затем медленно вводите содержимое шприца, поворачивая поршень иглы для введения 0,1 микролитра в минуту в течение пяти минут, для инъекции 0,5 микролитра. Дайте шприцу оставаться на месте в течение пяти минут.

По истечении отведенного времени извлеките животное из стереотаксиса, закройте разрез, и положите на согревающую подушку. Проводите послеоперационную анальгезию в соответствии с утвержденным протоколом для животных. Проводите поведенческое тестирование через два-три дня после стереотаксического введения вирусных частиц.

Приучите мышей к комнате не менее чем за четыре часа до начала эксперимента. Начните с растворения DOI в 0,9-процентном солевом растворе до двух миллиграммов на килограмм. Подготовьте домашнюю клетку без какой-либо подстилки и с помощью штатива отрегулируйте камеру так, чтобы она находилась прямо над домашней клеткой.

Откалибруйте камеру так, чтобы вся клетка дома оказалась в поле зрения. Взвесьте мышь и введите ее внутрибрюшинно в соответствующей дозе 0,9% физиологического раствора или DOI. Поместите мышь обратно в домашнюю клетку на десять минут.

Через десять минут поместите мышь в центр пустой домашней клетки и убедитесь, что в поле зрения камеры нет слепых зон. Нажмите кнопку записи на видеокамеру и выйдите из комнаты. Через 30 минут остановите запись и поместите мышь обратно в исходную домашнюю клетку.

Повторите поведенческий тест на следующей мыши. Попросите рецензента просмотреть видеозаписи вслепую к условиям эксперимента. Вручную записывайте каждое подергивание головы на протяжении всего видео.

Подергивание головы определяется как быстрое встряхивание головой, совершаемое мышью. Обрабатывайте данные так, как указано в письменной части протокола. Здесь показано репрезентативное изображение экспрессии трансгенов, опосредованной ВПГ в лобной коре.

ВПГ mGlu2 GFP вводили в лобную кору головного мозга, и экспрессия GFP была выявлена с помощью иммуноцитохимии. Эта масштабная линейка представляет собой 200 микрон. На этом изображении показан вестерн-блоттинг экспрессии трансгенов, опосредованной ВПГ, и реактивности анти-mGlu2 в лобной коре мышей с нокаутом mGlu2.

Здесь мы измерили иммунореактивность mGlu2 в виде мономера. Эта гистограмма показывает, что вирусно-опосредованная экспрессия mGlu2, но не химерного mGlu2 в лобной коре мышей с нокаутом mGlu2 значительно снижает реакцию на подергивание головы, вызванную галлюциногенным агонистом рецептора сератонина 2a DOI. Наиболее важными шагами в этом эксперименте являются время между инъекциями вируса, реакция на подергивание головы и когда мыши приносятся в жертву.

Любая задержка может изменить результаты эксперимента или внести неоднозначность в данные. После освоения операция на мышах займет около 30 минут, чтобы ввести вирус. Эксперимент с подергиванием головы также должен занимать примерно 35 минут на каждую мышь.

Рекомендуются масштабные операции или операции на более чем одной мыши одновременно. Таким образом, можно поддерживать временную шкалу, которая позволяет проводить эксперименты с подергиванием головы в течение трех-четырех дней после операции, что является пиковым временем экспрессии вирусной конструкции. Спасибо за просмотр и удачи в вашем эксперименте.