HSV-опосредованной Transgene экспрессия химерных конструктов для изучения поведенческой Функция GPCR гетеромеров у мышей

Общая цель данного метода заключается в наблюдении за тем, как вирус-опосредованный перенос генов влияет на поведенческие фенотипы, требующие гетеродимеризации рецепторов, сопряженных с G-белком, на моделях мышей. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейро- и психофармакологии, в частности, о том, как рецепторы, сопряженные с G-белком, взаимодействуют друг с другом на молекулярном уровне.

Используя данный метод, мы можем понять, как это взаимодействие влияет на поведение в моделях психических расстройств, таких как шизофрения и депрессия. С помощью этого метода мы детально изучим серотониновый рецептор 2a и метаботропный глутаматный рецептор 2, каждый из которых, как было показано, участвует в механизме действия препаратов, используемых для лечения пациентов с шизофренией. Начните с надлежащей анестезии мыши в соответствии с утвержденными методами.

Убедитесь в достижении хирургического уровня анестезии, проведя тест с пережатием пальца лапы (toe pinch) и зафиксировав отсутствие реакции. Затем нанесите офтальмический гель для защиты глаз. Закрепите мышь в стереотаксической раме, отрегулировав наклон головы так, чтобы череп находился в горизонтальном положении и был ровным.

Нанесите повидон-йод на открытый участок кожи головы. С помощью скальпеля сделайте сагиттальный разрез по срединной линии черепа в пределах открытой выбритой области. Затем зафиксируйте кожу в месте разреза зажимами Pureit, чтобы обеспечить постоянный доступ к черепу.

Нанесите перекись водорода для растворения надкостницы и обнажения швов черепа. Теперь, когда брегма и швы стали видны, обязательно отрегулируйте стереотаксическую раму, чтобы обеспечить горизонтальное положение черепа. Совместите кончики игл шприцев с брегмой и зафиксируйте координаты брегмы.

Для двустороннего введения препарата во фронтальную кору прибавьте 1,6 mm к зарегистрированной ростро-каудальной координате брегмы и 2,6 mm к зарегистрированной медиально-латеральной координате брегмы. Отметьте места инъекций на черепе, после чего просверлите в этих местах небольшие отверстия. С помощью ватного тампона удалите излишки крови или фрагменты кости.

Подведите иглу к поверхности мозга и опустите её на глубину, соответствующую дорсо-вентральной координате. Затем медленно введите содержимое шприца, поворачивая plunger иглы, со скоростью 0.1 µL в минуту в течение пяти минут, чтобы ввести в общей сложности 0.5 µL. Оставьте шприц на месте на пять минут.

По истечении установленного времени извлеките животное из стереотаксиса, зашейте разрез и поместите его на грелку. Введите послеоперационные анальгетики в соответствии с утвержденным протоколом работы с животными. Проведите поведенческое тестирование через два-три дня после стереотаксического введения вирусных частиц.

Перед началом эксперимента подвергните мышей привыканию к помещению в течение как минимум четырех часов. Начните с растворения DOI в 0,9% растворе физиологического раствора до концентрации 2 мг/кг. Подготовьте домашнюю клетку без подстилки и с помощью штатива установите камеру так, чтобы она находилась непосредственно над клеткой.

Отрегулируйте камеру так, чтобы вся домашняя клетка находилась в поле зрения. Взвесьте мышь и введите внутрибрюшинно соответствующую дозу либо 0,9% физиологического раствора, либо DOI. Поместите мышь обратно в домашнюю клетку на десять минут.

Через десять минут поместите мышь в центр пустой домашней клетки и убедитесь, что в поле зрения камеры нет слепых зон. Нажмите кнопку записи на видеокамере и покиньте помещение. Через 30 минут остановите запись и верните мышь в исходную домашнюю клетку.

Повторите поведенческий тест на следующей мыши. Поручите эксперту просмотр видеозаписей в режиме слепого метода, без знания условий эксперимента. Вручную зафиксируйте каждое подергивание головы на протяжении всего видео.

Подергивание головы определяется как быстрое трясущееся движение головы, совершаемое мышью. Обработайте данные в соответствии с описанием в текстовой части протокола. Здесь представлено репрезентативное изображение экспрессии трансгена, опосредованной HSV, в фронтальной коре.

HSV mGlu2 GFP вводили в фронтальную кору; экспрессия GFP была выявлена с помощью иммуноцитохимического анализа. Данный масштабный отрезок соответствует 200 microns. На этом изображении представлен вестерн-блот экспрессии трансгена, опосредованной HSV, и реактивности anti-mGlu2 в фронтальной коре мышей с нокаутом mGlu2.

Здесь мы измерили иммунореактивность mGlu2 в форме мономера. Данная гистограмма показывает, что вирус-опосредованная экспрессия mGlu2, но не химерного mGlu2 в фронтальной коре мышей с нокаутом mGlu2, значительно восстанавливает реакцию в виде подергивания головой, индуцированную галлюциногенным агонистом серотониновых рецепторов 2a DOI. Наиболее критическими этапами данного эксперимента являются интервалы времени между вирусными инъекциями, возникновением реакции подергивания головой и моментом забора материала у мышей.

Любая задержка может изменить результаты эксперимента или внести неопределенность в данные. После освоения техники хирургическая операция на мыши, включая инъекцию вируса, будет занимать примерно 30 минут. Эксперимент по исследованию подергивания головы также должен занимать примерно 35 минут на одну мышь.

Рекомендуется проводить операции поэтапно, оперируя более чем одну мышью одновременно. Это позволит соблюдать график, при котором эксперименты по анализу подергиваний головы будут проведены через три-четыре дня после операции, что соответствует пику экспрессии вирусной конструкции. Благодарим за просмотр и желаем удачи в вашем эксперименте.