Эффективная и высокая Метод Выход для выделения мышиных дендритных клеток подмножествах

Общей целью данного протокола является разработка высокоэффективного и высокопродуктивного метода генерации дендритных клеток или ДК, которые судьбоносно отражают их фенотипическую и функциональную дивергенцию in vivo. Дендритные клетки существуют в виде больших популяций в лимфоидных органах. Поэтому мы используем фильтрующий лиганд для увеличения частоты этих важных клеток в донорских тканях, чтобы облегчить эту изоляцию.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что он исключает генерацию всех подмножеств DC в подходящих для анализа количествах с использованием только коммерчески доступных агентов. Чтобы получить flt-3 лиганд, экспрессирующий клетки меланомы B16 из 90% конфлюентной культуры, сначала промойте клетки PBS и инкубируйте культуру с 05% трипсином при 37 градусах Цельсия. Через 5 минут погасите активность протеазы 20 миллилитров 4 градусов Цельсия и отделите слой адгезивной модели клетки легким постукиванием и аккуратным пипетированием.

Соберите клетки центрифугированием и подсчитайте их. Затем повторно суспендируйте суспензию одиночных клеток в 1 раз до концентрации 8 клеток на миллилитр в PBS для их подкожного введения мышам-реципиентам C57 black 6. Когда опухоль достигнет от двух до десяти миллилитров в диаметре, соберите селезенку у животных, несущих опухоль, и поместите селезенку в чашку Петри, содержащую свежую среду RPMI.

С помощью скальпеля разрежьте ткани на кусочки по 0,2 квадратных сантиметра, а затем инкубируйте фрагменты в десяти миллилитрах коллагеназы и Dnase при температуре 37 градусов Цельсия. Через 30 минут вылейте частично переваренную тканевую кашицу на сетчатое фильтр для клеток размером 70 микрон и с помощью пятимиллилитрового поршня шприца продавите оставшиеся фрагменты ткани через сетку ситечка. Промойте фильтр 10 миллилитрами свежей среды, объединив промывку с остатками одиночной суспензии и гранулируйте ячейки.

Суспензируем клеточную гранулу в 2 миллилитрах буфера для лизиса эритроцитов при комнатной температуре на 10 минут. Затем промойте клетки в 10 миллилитрах свежей среды RPMI и повторно суспендируйте их в соотношении от 1 до 10 до 8 клеток на миллилитр в буфере для сортировки клеток, содержащем блок FC. Для выделения ДК цитод плазмы крови необходимо тщательно смешать 300 микролитров меченного биотином коктейля антител из набора для выделения ДК цитод плазмы с 200 микролитрами суспензии одиночных клеток селезенки.

Поместите клетки на ледяную водяную баню на 15 минут, с легкими постукиваниями каждые три минуты. Затем промойте ячейки 12 миллилитрами буфера для сортировки клеток, и повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах свежего сортировочного буфера. Далее инкубируйте клетки в 300 микролитрах антибиотина, конъюгированных шариков антител еще 15 минут в ледяной воде с регулярным постукиванием.

После промывки ячеек в свежем сортировочном буфере снова подвесьте поддон в 2 миллилитрах буфера для сортировки ячеек и загрузите магнитную колонку соответствующего размера на соответствующий магнит. Уравновесьте колонку пятью миллилитрами свежего буфера для сортировки клеток 4 градуса Цельсия. Когда весь буфер стекнет с верхней части колонны, осторожно добавьте ячейки в центр поверхности верхней части колонны и соберите проточные воды.

Затем вымойте колонку с 10 миллилитрами свежего, 4 градуса Цельсия сортировочным буфером и соберите проточный в ту же пробирку. После прохождения через вторую магнитную колонку можно ожидать популяцию цитодных дендритных клеток плазмы с чистотой более 94%. Чтобы выделить CD8aplha+ и CD8alpha-DCs, смешайте оставшуюся часть суспензии клеток селезенки со 100 микролитрами коктейля биоионных конъюгированных антител из набора для выделения CD8alpha+дендритных клеток в течение 15 минут на льду с легким постукиванием, как только что было показано.

В конце инкубации промойте клетки в 12 миллилитрах буфера для сортировки клеток при температуре 4 градуса Цельсия и повторно суспендируйте гранулу в 150 микролитрах свежего буфера для сортировки клеток при температуре 4 градуса Цельсия. Затем смешайте клетки со 100 микролитрами антибиотиновых гранул набора для выделения CD8alpha+дендритных клеток. Через 15 минут на льду с легким постукиванием промойте ячейки в 10 миллилитрах 4 градуса Цельсия в сортировочном буфере, и повторно суспендируйте гранулы в 1 миллилитр свежего сортировочного буфера 4 градуса Цельсия.

В конце инкубации отсортируйте ячейки путем разделения магнитных шариков, как только что было продемонстрировано, собирая проточные и первые промывки. Затем раскрутите ячейки вниз и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре свежего буфера для сортировки клеток при температуре 4 градуса Цельсия. Теперь пометьте клетки 200 микролитрами магнитных шариков, сопряженных с анти-CD8aplha из набора, и пропустите клетки через новую колонку, собирая поток CD8альфа-дендритных клеток.

Чтобы собрать CD8alpha+DCs, перенесите колонку в коническую пробирку объемом 15 миллилитров и пропустите через колонку 5 миллилитров свежего буфера для сортировки клеток 4 градусами Цельсия. После пропуска клеток через вторую колонку можно ожидать популяцию CD8alpha+дендритных клеток более 96%. Чтобы изолировать CD8alpha-клетки, вращают проточную клеточную суспензию CD8alpha.

Затем пометьте клетки 100 микролитрами анти-CD11 с-магнитных гранул и соберите популяцию магнитных гранул, положительную для магнитных гранул, как только что было показано, чтобы получить субпопуляцию CD8альфа-дендритных клеток более чем на 97%. Наконец, определите количество живых клеток, путем исключения трипанового синего. Как только опухоль становится пальпируемой, мыши-носители опухоли B16 flt-3 лиганда постоянно демонстрируют резкое увеличение клеточности селезенки, что коррелирует с расширением субпопуляций дендритных клеток селезенки.

Интересно, что в то время как для обычных ДК у этих животных наблюдается 15-20-кратное увеличение абсолютного числа клеток, только около 4-кратного увеличения наблюдается для подмножества цитод плазмы крови. Различные субпопуляции дендритных клеток характеризуются в соответствии с их экспрессией B220, CD11b, CD11c и CD8alpha. Клеточные популяции также демонстрируют другие уникальные субпопуляционные маркеры, при этом mPDCA1 экспрессируется исключительно на ДК цитоды плазмы DEC205 и высоко экспрессируется на CD8alpa+DCs, а CD11b и 33D1 наиболее заметно обнаруживаются на CD8альфа-ДК.

Используя этот метод, мы продемонстрировали, что CD8alpa+DC являются наиболее эффективными в презентации антигенов молекулами, связывающими CD со специализированной популяцией Т-клеток, известной как инвариантные NKT-клетки. Наиболее важной особенностью изоляции ДК является поддержание строгой стерильности и отсутствия антидооксантов. Во время процедур эти Т-клетки обладают высокой чувствительностью к антидоксанту.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о бережном обращении с клетками, так как повторная механическая стимуляция может изменить состояние созревания дендтритических клеток. После освоения этот метод может быть использован для выделения большого числа всех основных подмножеств ДК из одной селезенки. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.