Развития и функциональная характеристика мышиных Tolerogenic дендритных клеток

Общей целью данного протокола является разработка и характеристика мышиных толерогенных дендритных клеток для оценки их иммунотерапевтической полезности в лечении аутоиммунных заболеваний, таких как рассеянный склероз. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области терапии толерогенными дендритными клетками, предоставляя стандартизированный метод для разработки и функциональной характеристики толерогенных дендритных клеток. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что его можно использовать для успешного развития толерогенных дендритных клеток и для тестирования эффективности функциональных толерогенных дендритных клеток.

Последствия этого метода значительны. Они направлены на развитие клеточной иммунотерапии аутоиммунных заболеваний, поскольку толерогенные дендритные клетки могут сбрасывать аномальный иммунный ответ, оставаясь при этом подверженными внутренним иммунным регуляторным механизмам. После забора костей задних конечностей у восьми-10-недельных мышей C57BL/6, в соответствии со стандартными протоколами, с помощью хирургических лезвий и щипцов рассекают как можно больше тканей и помещают чистые голени и бедренные кости в шестисантиметровую чашку для культивирования, содержащую 70% этанола.

Обрежьте оба конца костей хирургическим лезвием и с помощью трехмиллилитрового шприца, оснащенного иглой 23 калибра, промойте костный мозг от первой кости тремя миллилитрами PBS в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Когда весь костный мозг будет собран, центрифугируйте клеточную суспензию и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре буфера для лизиса эритроцитов. Через пять минут прекратите лизис девятью миллилитрами PBS и соберите клетки центрифугированием.

Ресуспендируйте гранулу клеток белого костного мозга в 10 миллилитрах питательной среды и отфильтруйте клетки через клеточный фильтр 40 микрометров в новую пробирку. Доведите клетки до концентрации от 10 до 10 до шестой клетки на миллилитр в питательной среде с добавлением GM-CSF и IL-4. И поместите по три миллилитра клеток в каждую лунку 6-луночного планшета для трехдневной инкубации при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.

На третий день промойте клетки в каждой лунке двумя миллилитрами PBS и осторожно помешайте, чтобы удалить неадгезивные клетки. Затем скармливают клеткам по три миллилитра свежей питательной среды с добавлением GM-CSF и IL-4 и возвращают клетки в инкубатор для клеточных культур, добавляя в каждую лунку еще по три миллилитра свежей питательной среды, дополненной цитокинами, через двое суток. На седьмой день культуры положите тарелку на лед.

Через 10 минут осторожно внесите питательную среду в каждую лунку, чтобы вытеснить слабо прилегающие, незрелые, полученные из костного мозга дендритные клетки в суспензию. Затем объедините клетки для сбора методом центрифугирования и повторно суспендируйте гранулу в соответствующем объеме свежей питательной среды для последующего анализа. Чтобы измерить пролиферацию сингенных Т-клеток, сначала используйте заднюю часть 3-миллилитрового поршня шприца, чтобы размять селезенку от 8-10-недельной мыши OT2 C57BL/6 через клеточное ситечко 40 микрометров и промыть ситечко PBS.

Гранулируйте объединенную клеточную суспензию центрифугированием и ресуспендируйте гранулу в 400 микролитрах магнитного буфера для сортировки клеток и 100 микролитрах CD4-положительного биотинового коктейля Т-клеток при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. В конце инкубации добавьте 300 микролитров сортировочного буфера и 200 микролитров гранул антибиотина в клетки на 10-минутную инкубацию при четырех градусах Цельсия и поместите магнитную колонку для шариков и фильтр предварительного разделения в магнит для разделения клеток соответствующего размера. Промойте колонку тремя миллилитрами сортировочного буфера и добавьте в ячейки девять миллилитров сортировочного буфера.

После центрифугирования повторно суспендируйте ячейку и гранулу гранул в трех миллилитрах сортировочного буфера и добавьте клеточную суспензию в колонку для сбора CD4-положительных Т-клеток, элюирующих в соответствующую емкость. Затем промойте колонку еще тремя миллилитрами сортировочного буфера, собрав проточный поток, и поместите Т-клетки на лед. Для выделения дендритных клеток сингенной селезенки поместите селезенку восьми-десятинедельной мыши C57BL/6 в шестисантиметровую чашку для культивирования и с помощью одномиллилитрового шприца, оснащенного иглой 25 калибра, введите один миллилитр раствора коллагеназы D в селезенку два раза.

Далее с помощью ножниц разрежьте селезенку на мелкие кусочки и выдержите кусочки при встряхивании при комнатной температуре в течение 25 минут. В конце инкубации добавьте 500 микролитров 0,5 моляра ЭДТА в тканевую суспензию для заключительной пятиминутной инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации используйте заднюю часть трехмиллилитрового поршня шприца, чтобы размять суспензию селезенки через сетчатое фильтр для клеток 40 микрометров и собрать клетки путем центрифугирования.

Ресуспендируйте гранулу в 350 микролитрах буфера для сортировки магнитных клеток, 50 микролитрах реагента, блокирующего рецепторы Fc, и 100 микролитрах коктейля биотина и антител дендритных клеток для 10-минутной инкубации при четырех градусах Цельсия. В конце инкубации промойте клетки в девяти миллилитрах сортировочного буфера и повторно суспендируйте гранулу в 800 микролитрах свежего сортировочного буфера с 200 микролитрами антибиотиновых гранул при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут для выделения популяции дендритных клеток селезеночной сковороды с помощью магнитной сортировки шариков, как только что продемонстрировано. Ресуспендируйте клетки в соотношении от 10 до 10 до пятой части на миллилитр и обрабатывайте их соответствующей экспериментальной концентрацией исследуемого тритерпеноида в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия.

В течение последней трети инкубации повторно суспендируйте Т-клетки в концентрации от 10 до 7 клеток на миллилитр в одном микромолярном CFSE в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем промойте клетки PBS и отрегулируйте объем до конечной концентрации в два раза от 10 до шестой Т-клеток на миллилитр. Совместно культивировали 100 микролитров обработанных дендритных клеток со 100 микролитрами меченых CFSE CD4-положительных Т-клеток в каждой лунке 96-луночного планшета и добавляли 100 нанограммов на миллилитр пептида OVA 323-329 к клеткам, измеряя интенсивность CFSE Т-клеток с помощью проточной цитометрии после двух-трех дней инкубации.

Клетки-предшественники костного мозга, культивируемые в полной среде, в присутствии GM-CSF и IL-4, демонстрируют незрелую морфологию дендритных клеток после шести дней в культуре. Анализ незрелых дендритных клеток, полученных из костного мозга седьмого дня, показал устойчивую экспрессию CD11c, специфического маркера дендритных клеток мышей, большинством культивируемых клеток. Несмотря на отсутствие влияния на экспрессию маркеров созревания, индуцированных ЛПС, дендритные клетки, полученные из костного мозга, демонстрируют толерогенный профиль дендритных клеток в ответ на лечение CDDO-DFPA, о чем свидетельствует значительное снижение экспрессии провоспалительных генов и повышенная экспрессия гена противовоспалительных цитокинов даже после стимуляции ЛПС.

Кроме того, значительное снижение сингенной OVA-специфичной пролиферации Т-клеток наблюдается в кокультурах in vitro, в которых OVA представлена дендритными клетками, обработанными CDDO-DFPA, и in vivo, о чем свидетельствует замедленное прогрессирование до экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита после инъекции дендритных клеток, обработанных MOG-импульсом CDDO-DFPA, что еще раз подтверждает толерогенный фенотип этих клеток. Как только этот метод будет освоен, толерогенные дендритные клетки могут быть созданы в течение восьми дней, если эксперименты будут проведены правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что толерогенные дендритные клетки не являются однородными.

Их клеточный фенотип зависит от природы агентов, используемых для индукции их толерантности. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как детальный проточный цитометрический анализ, чтобы ответить на дополнительные вопросы об энергии или апоптозе антигенно-специфических Т-клеток, индуцированной толерогенными дендритными клетками, или о способности к дифференцировке Т-клеток. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как развивать функционально-активные толерогенные дендритные клетки с использованием известных агентов или как проверить способность новых веществ индуцировать эти клетки.