Подготовка фрагментов острого мозга, с помощью оптимизированного N-метил-D-glucamine защитные восстановления метод

Этот протокол демонстрируется реализация оптимизированной N-метил-D-glucamine (NMDG) защитные восстановления метод подготовки срез мозга. Один СМИ формулировка используется надежно получить здоровый мозг кусочки от животных, любого возраста и для различных экспериментальных приложений.

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы получить здоровые срезы мозга зрелых взрослых животных, которые подходят для экспериментов по электрофизиологии с пластырем. Таким образом, этот оптимизированный метод защитного восстановления NMDG для подготовки срезов мозга позволяет исследователям исследовать внутренние и синаптические свойства типов клеток мозга во многих различных областях мозга и для животных практически любого возраста. Таким образом, основное преимущество именно этой методики заключается в том, что она позволяет получать срезы мозга, которые имеют более высокую степень сохранности нейронов по сравнению с предыдущими методологиями.

А также о том, что эти срезы мозга больше подходят для записи патч-клэмпа. Этот метод был оптимизирован для тканей мозга взрослых мышей. Он может быть использован для лечения множества других видов, включая нейрохирургически резецированную ткань мозга человека.

Чтобы начать эту процедуру, настройте станцию нарезки с машиной для слайсера и хирургическими инструментами. Прикрепите циркониевое керамическое инжекторное лезвие к рычагу лезвия с помощью быстрого клея. Затем вставьте держатель образца и совместите переднюю кромку лезвия с ободом держателя образца.

Оставляя крошечный зазор, лезвие не царапает металл. Наполните стакан объемом 250 миллилитров 200 миллилитров NMDG HEPES aCSF. И предварительно охладить его на льду с постоянным карбогенированием более 10 минут.

Затем установите первоначальную камеру для восстановления среза мозга, заполнив ее 150 миллилитрами NMDG HEPES aCSF. И поставьте камеру на водяную баню при температуре от 32 до 34 градусов Цельсия. Чтобы установить камеру для хранения срезов мозга, наполните резервуар 450 миллилитрами HEPES aCSF и дайте ему нагреться до комнатной температуры при постоянной карбогенации до использования.

Далее приготовьте расплавленную агарозу для заделки в ткани, вырезав блок 2%-ной агарозы из заранее подготовленной посуды с помощью открытого конца конического флакона объемом 50 миллилитров. Неплотно закройте конический флакон крышкой, затем поставьте его в микроволновую печь на 10-30 секунд, пока агароза не начнет плавиться. Не перегревайтесь.

Разлейте расплавленную агарозу по 1,5 миллилитровым трубкам. Поддерживайте агарозу в расплавленном состоянии с помощью термомиксера, установленного на 42 градуса Цельсия, с энергичным встряхиванием. И тщательно следите, чтобы расплавленная агароза не застыла преждевременно.

В это время предварительно охладите вспомогательный охлаждающий блок для слайсера на льду. При этой процедуре делают надрез на коже головы, чтобы обнажить тюбетейку. Затем с помощью тонких ножниц для среза кожи над тюбетейкой.

И сделать небольшие надрезы латерально с обеих сторон каудального вентрального основания черепа. Сделайте дополнительные неглубокие надрезы, начиная с каудальной дорсальной части черепа, двигаясь в ростральном направлении вверх по дорсальной средней линии. Заботьтесь о том, чтобы не повредить основной мозг.

После этого сделайте окончательный Т-образный срез перпендикулярно средней линии на уровне обонятельных луковиц. Затем с помощью щипцов с круглым концом захватите череп, начиная с ростральной медиальной стороны, и отслаивайте в сторону каудального латерального направления с одной стороны. Повторите эту процедуру, чтобы другая сторона раскололась.

И удалите тыльные половинки тюбетейки, чтобы обнажить мозг. Аккуратно выньте неповрежденный мозг в стакан с предварительно охлажденным NMDG HEPES aCSF. И дайте мозгу равномерно остыть в течение примерно одной минуты.

Теперь с помощью большого шпателя перенесите мозг из стакана на чашку Петри, накрытую фильтровальной бумагой. Обрежьте и установите мозг в соответствии с предпочтительным углом среза и желаемой областью мозга, представляющей интерес. Работайте быстро, чтобы избежать длительного кислородного голодания во время работы.

После этого прикрепите мозговой блок к держателю образца с помощью клеевого клея. Втяните внутреннюю часть держателя для образцов, чтобы полностью втянуть мозговой блок внутрь. Затем вылейте расплавленную агарозу прямо в держатель до тех пор, пока мозговой блок полностью не покроется агарозой.

Затем зажмите предварительно охлажденный блок охлаждения принадлежностей вокруг держателя образца на десять секунд, пока агароза не затвердеет. Вставьте держатель образца в емкость на машине для слайсера и проверьте правильность выравнивания. После этого заполните резервуар оставшимся предварительно охлажденным кислородом NMDG HEPES aCSF из стакана объемом 250 миллилитров и поместите пузырьковый камень в резервуар на время нарезки, чтобы обеспечить достаточное насыщение кислородом.

Затем отрегулируйте микрометр, чтобы начать продвигаться вперед по образцу мозга, встроенному в агарозу. Запустите слайсер и опытным путем отрегулируйте скорость продвижения и частоту колебаний до нужного уровня. Продолжайте продвигаться вперед и разрезать ткань с шагом 300 микрометров до тех пор, пока интересующая область мозга не будет полностью разрезана.

Общее время на процедуру нарезки должно составлять менее 15 минут. Для первоначального восстановления NMDG. По завершении процедуры секционирования соберите все срезы с помощью обрезанной пластиковой пастбищной пипетки и перенесите их в камеру восстановления при температуре 34 градуса Цельсия, заполненную 150 миллилитрами NMDG HEPES aCSF.

Время этапа восстановления острого среза мозга очень важно для того, чтобы иметь возможность найти баланс между морфологическим сохранением и функциональным восстановлением электрофизиологических свойств каждого нейрона. После определения оптимального графика спайка натрия, в зависимости от возраста мыши, проводят процедуру Шаг Y с добавлением раствора спайка натрия в указанные объемы раствора спайка натрия в указанное время. Добавьте раствор натрия непосредственно в дымоход барботера камеры начального восстановления для быстрого перемешивания.

График всплесков натрия, который был предоставлен для различных возрастных диапазонов, является действительно хорошей отправной точкой. Но он должен быть оптимизирован и использован для вашего собственного конкретного экспериментального плана. После этого переложите все ломтики в камеру длительного хранения HEPES aCSF при комнатной температуре.

Дайте срезам восстановиться еще час в камере хранения HEPES перед экспериментами по записи патч-зажимов. Здесь представлены репрезентативные ИК-изображения ДВС, которые были получены из различных областей мозга и острых срезов трехмесячной мыши для оценки морфологической сохранности нейронов. Показанные здесь результаты получены при использовании контрольного метода защитной резки NMDG без защитной стадии восстановления.

В то время как эти результаты обусловлены оптимизированным методом защитного восстановления NMDG. В целом, улучшенная консервация нейронов наблюдается при оптимизированном методе защитного восстановления NMDG. Оптимизированный метод защитного восстановления NMDG с процедурой постепенного всплеска натрия сравнивали с исходным методом защитного восстановления NMDG.

Среднее время формирования гигаОмного уплотнения и регистрации патч-хомута было значительно и значительно сокращено, когда применялась процедура постепенного введения шипа натрия вместе с этапом защитного восстановления NMDG. Улучшенная сохранность нейронов, достигнутая с помощью этого метода среза мозга, облегчает сложные экспериментальные приложения, включая, помимо прочего, электрофизиологию многоэлектродного патч-зажима для исследования локальных синаптических связей. Как показано здесь, с использованием срезов мозга взрослого человека ex vevo неокортикальных срезов, полученных в результате нейрохирургии.

После просмотра этого видео ученые должны хорошо понять, как реализовать наш оптимизированный метод защитного восстановления NMDG, включая новую процедуру спайка натрия, которую мы описали, для подготовки срезов мозга, пригодных для записи с помощью патч-фикса. Таким образом, после освоения этого протокола должна быть возможность выполнять процедуру среза мозга менее чем за один час каждый день. И должен давать качественные воспроизводимые срезы мозга и будет работать для животных практически любого возраста.

Таким образом, эта процедура, этот метод может помочь подготовить срезы мозга, которые подходят для решения вопросов о функционировании мозга с использованием таких методов, как электрофизиология, оптическая визуализация в реальном времени и оптогенетика, анализы трафика рецепторов и другие виды функциональных анализов для изучения функции типов клеток мозга. Таким образом, этот метод также полезен, потому что он поможет исследователям иметь возможность функционально исследовать различные области мозга, включая области мозга, которые традиционно не поддаются записи от взрослых животных в срезах мозга.