Мышиные Hind Лимб длинных трубчатых костей Вскрытие и костного мозга Изоляция

Общей целью этой процедуры рассечения длинных костей и выделения костного мозга является быстрое и систематическое удаление длинных костей и сбор костного мозга для дальнейшего анализа. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, связанные с биологией костного мозга, метастазированием рака и иммунологией. Основным преимуществом данной методики является то, что процесс рассечения проходит быстро и стандартизировано, процедура выделения костного мозга достаточно стерильна, начинают с позиционирования мыши в положении лежа на спине.

Затем приколите все четыре подушечки лап ниже голеностопного сустава и опрыскайте мышь 70% этанолом, тщательно обливая ноги. Затем сделайте небольшой разрез справа от средней линии в нижней части живота чуть выше бедра и продлите разрез вниз по ноге и за голеностопный сустав. Оттяните кожу.

Затем разрежьте четырехглавую мышцу, прикрепленную к проксимальному концу бедренной кости, чтобы обнажить переднюю сторону бедренной кости, и вырвите мышцу из ноги штифтом под углом 45 градусов от доски. Приложив ножницы к задней стороне бедренной кости, отрежьте подколенные сухожилия от коленного сустава. Затем оттяните назад мышцы кожи и подколенного сухожилия, прикрепленные к проксимальному концу бедренной кости, чтобы обнажить заднюю сторону кости, и выведите мышцы подколенного сухожилия из ноги, расположив штифт под углом 45 градусов.

С помощью щипцов возьмитесь за дистальный конец бедренной кости чуть выше коленного сустава. Затем направьте лезвия ножниц по обе стороны бедренного стержня к тазобедренному суставу. Дойдя до головки бедренной кости, поверните ножницы, перемещая верхнее лезвие прямо над головкой бедренной кости, чтобы вывихнуть бедренную кость.

Теперь возьмитесь щипцами за верхнюю часть бедренного стержня и отрежьте мягкие ткани от головки бедренной кости, чтобы освободить бедренную кость от вертлужной впадины. Затем потяните всю кость ноги, включая бедренную кость, колено и большеберцовую кость, вверх и в сторону от тела, и осторожно отрежьте соединительную ткань и мышцы, прикрепляющие ногу к коже. Когда вся соединительная ткань будет удалена, перенатяните голеностопный сустав и поверните ножницы, как только что было показано, чтобы вывих большеберцовой кости.

Взявшись за дистальный конец большеберцовой кости и стараясь не разорвать сухожилия, потяните большеберцовую кость вверх и в сторону от тела и штифтовой доски. Затем удалите любую оставшуюся соединительную ткань, прикрепленную к длинной кости в колене, и любую дополнительную мышцу или соединительную ткань, прикрепленную к бедренной кости и большеберцовой кости. Чтобы подготовить длинную кость к выделению костного мозга, возьмитесь за бедренную кость так, чтобы коленная чашечка была обращена в сторону, а головка бедренной кости — вниз.

Перенапрягите коленный сустав и поверните ножницы, чтобы вывихнуть большеберцовую кость от бедренной кости. Затем удалите всю соединительную ткань, удерживающую бедренную и большеберцовую кости вместе. Затем возьмитесь за бедренную кость передней стороной наружу и головкой бедренной кости вниз и направьте ножницы вверх по бедренному стержню к мыщелкам.

Аккуратно вращайте ножницами вперед и назад, чтобы удалить мыщелки, надколенник и эпифиз, обнажив метафиз. Затем с помощью щипцов, ножниц и салфеток Kimwipes удалите любые дополнительные мышцы или соединительную ткань, прикрепленную к бедренной кости. Затем возьмитесь за большеберцовую кость передней стороной наружу и концом лодыжки вниз.

Если эпифиз большеберцовой кости не поврежден, проведите ножницы вверх по стволу большеберцовой кости к мыщелкам и осторожно вращайте ножницы вперед и назад, чтобы удалить мыщелки и эпифиз, обнажив метафиз большеберцовой кости. Затем удалите все дополнительные мышцы или соединительную ткань, прикрепленные к большеберцовой кости, как показано только что. Чтобы собрать костный мозг, сначала протолкните иглу 18 калибра через дно микроцентрифужной пробирки объемом 0,5 миллилитров.

Затем поместите длинные косточки в трубку коленным концом вниз и закройте крышку. Поместите микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 мл в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируйте пробирки при давлении больше или равном 10 000 g в микроцентрифуге в течение 15 секунд. Убедитесь, что костный мозг был выведен из костей при визуальном осмотре.

Кости должны казаться белыми, а в большой трубке должна быть видна крупная гранула. Затем выбросьте кости в микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 миллилитра и поддержите костный мозг в соответствующем растворе для желаемого последующего анализа. Этот метод быстрой диссекции подходит для ряда последующих анализов, включая гистоморфометрию и гистологию.

Действительно, как показала эта репрезентативная гистоморфометрическая 3D-реконструкция с помощью микрокомпьютерной томографии, как губчатая кость, так и кортикальная оболочка сохраняются, что позволяет точно количественно оценить стандартизированные структурные параметры для гистоморфометрии кости. В этом репрезентативном гистологическом срезе формальной, неподвижной и декальцинированной голени, окрашенной H и E, можно наблюдать за поддержанием целостности как кальцинированной кости, так и клеточного костного мозга для гистологического анализа. Кроме того, костный мозг, выделенный с помощью этой процедуры, подходит для многих последующих применений, включая первичную клеточную культуру остеокластов или остеобластов.

После освоения техника может быть завершена примерно за семь минут, от длительного рассечения кости до изоляции костного мозга, если она выполнена правильно. Пытаясь провести процедуру, важно помнить о положении мыши для облегчения вскрытия. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как FACS или другие процессы с отдельными клетками, чтобы ответить на дополнительные вопросы, касающиеся изменений в популяциях клеток костного мозга.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как быстро вскрыть длинные кости мышей и изолировать костный мозг методом центрифугирования.