Остеокластов Вывод из костного мозга мыши

Общая цель этой процедуры заключается в выделении остеокластов из костного мозга мыши в больших количествах. Это достигается путем сбора костей у усыпленных мышей. Затем клетки освобождаются от костного мозга с помощью ступки и пестика, чтобы измельчить кости в буфере.

Затем раствор костного мозга наносится слоями на среду разделения клеток с градиентом плотности и проводится разделение клеток с градиентом плотности. Наконец, слой, содержащий интересующие клетки, аспирируют, и клетки помещают в среду для индукции микрофагов костного мозга. В конечном итоге окрашивание ловушки используется для того, чтобы показать наличие большого количества остеокластов.

Применение этого метода распространяется на заболевания, связанные с измененной функцией остеокластов, которые могут варьироваться по степени тяжести от летального неонатального заболевания из-за неспособности сформировать пространство костного мозга для гемопоэза до более частых патологий, таких как остеопороз, поскольку он обеспечивает надежный метод выделения большого количества остеокластов из костного мозга мыши. Для начала принесите 10 миллилитров коммерчески доступного градиентного разделения ячеек средней или комнатной температуры в конической пробирке объемом 50 миллилитров. Поместите 50 миллилитровую аликвоту буфера для факса при комнатной температуре, которая будет использоваться со средой для разделения ячеек с градиентом плотности.

После подготовки дополнительной среды и усыпления мыши C 57 black six, согласно текстовому протоколу, поместите мышь на доску для препарирования и используйте 70% этанол. Чтобы распылить его, собирают урожай фера голени гуд глаз и позвоночник. Затем поместите кости в буфер на лед.

Далее, используя чистую папиросную бумагу, удалите мышцы и мягкие ткани из костей. Поместите косточки в ступку и примочите с помощью трех миллилитров фактов и аккуратно раздавите их. Затем аспирируйте окровавленную жидкость и пропустите ее через ситечко 70 микрометров в коническую трубку объемом 50 миллилитров.

Добавьте еще пять миллилитров буфера эффектов к измельченной кости и раздавите дальше, прежде чем перелить жидкость через ситечко в 50-миллилитровую пробирку. Продолжайте этот процесс до тех пор, пока жидкость не перестанет окрашиваться в красный цвет, прежде чем гранулировать костный мозг при давлении 200 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Чтобы выполнить градиентное разделение, аспирируйте надосадочную жидкость из клеточной гранулы и используйте 10 миллилитров факсимильного буфера для реанимации.

Подвешиваем таблетку, наклоняем коническую трубку с градиентом плотности клеток комнатной температуры примерно на 30 градусов и с помощью электрической пипетки кончиком пипетки прижимаем к внутренней верхней поверхности пробирки. Медленно наносите раствор костного мозга на среду с помощью центрифуги комнатной температуры без ускорения или замедления. Вращайте градиент со скоростью 200 G в течение 15 минут.

Затем отсасывайте помутневший средний слой, в котором находятся интересующие клетки, и перенесите их в новую коническую трубку. Добавьте 20 миллилитров ледяного буфера для факса, чтобы промыть ячейки. Затем используйте один миллилитр микрофаговой среды, стимулирующей костный мозг, для ресуспендирования конечной клеточной гранулы после подсчета клеток.

Помещают по два миллилитра микрофаговой стимулирующей среды в каждую лунку 24-луночного планшета. Затем добавьте 200 000 клеток в каждую лунку, плотность клеток которой обеспечит адекватное культивирование остеокластов in vitro. Аккуратно взбалтывайте планшет и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия без смены среды в течение трех дней.

После третьего дня смените среду на среду для индукции остеокластов костного мозга и начните менять ее ежедневно в течение пяти-семи дней. В этот момент должны быть видны крупные многоядерные остеокласты. Обратитесь к текстовому протоколу окрашивания и анализу резорбции, как показано здесь.

Большое количество остеокластов может быть подтверждено с помощью тартратно-резистентного анализа. Фосфотаты, окрашивающие остеокласты, визуализируются в виде больших фиолетовых клеток с несколькими ядрами с использованием протокола, продемонстрированного в этом видео. Обычно остеокласты выделяют с 30 ядрами в клетке.

Использование минерализованной поверхности считается золотым стандартом для оценки резорбтивной активности остеокластов in vitro. На этом рисунке светлопольная микроскопия с 10-кратным увеличением показывает процент минерализованной поверхности или резорбтивных ямок, которые сформированы, как показано черным цветом, что позволяет определить резорбтивную способность остеокластов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как надежно изолировать большое количество остеокластов из костного мозга мыши.