Оптический Клиринговый нервной системы мыши Центральной использованием пассивных ЯСНОСТИ

Общая цель этого протокола — продемонстрировать модификации исходного протокола CLARITY, которые дают более согласованные и экономически эффективные результаты. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы нейробиологии, такие как трехмерная морфология и связь в центральной нервной системе. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она улучшает стабильность оптического очищения и микроскопии в центральной нервной системе мыши.

Экономичным и воспроизводимым способом. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение. Конструкция камеры визуализации сложна и не так очевидна из письменного описания.

Получение параформальдегида фиксированной ткани головного и спинного мозга от мышей, экспрессирующих флуоресцентные белки. Гемисекцию мозга можно, поместив его в пластиковую мышиную матрицу мозга и разрезав по средней линии матричным лезвием. Добавьте каждое полушарие и спинной мозг в отдельные центрифужные пробирки объемом 50 миллилитров.

Каждый содержит по 40 миллилитров раствора гидрогеля. Накройте трубки алюминиевой фольгой, чтобы защитить флуорофоры. И инкубируйте пробирки с образцами и гидрогелем при температуре четыре градуса Цельсия с легким встряхиванием в течение семи дней.

По истечении инкубационного периода отбраковывайте 25 миллилитров гидрогеля, оставляя образец, и примерно 25 миллилитров гидрогеля в центрифужной пробирке. Затем деоксигенируйте образец, сняв крышку, поместив пробирку центрифуги в банку с влагопоглотителем и подключив банку к вакууму. Приложите вакуум не менее чем на 10 минут.

Аккуратно встряхните, чтобы выбить пузырьки выделяемого кислорода. Через 10 минут замените вакуум в банке с эксикатором на 100% газообразный азот в течение двух-трех минут. Как только давление выровняется и верхнюю часть банки с эксикатором можно будет открыть, быстро закройте трубку, чтобы предотвратить повторное поступление кислорода.

Далее полимеризуйте гидрогель, поместив пробирку с образцом в водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия на три часа до полного завершения полимеризации. Через три часа полимеризованный гидрогель приобретет гелеобразную консистенцию. С помощью шпателя извлеките полимеризованный образец из пробирки центрифуги, затем отрежьте излишки гидрогеля из образца.

Наконец, удалите остатки гидрогеля, поместив образец на безворсовую салфетку и аккуратно потирая и скручивая ткань по ней, оставляя на образце только тонкий слой полимеризованного гидрогеля. Чтобы начать процесс удаления липидов, переложите полимеризованный образец в чистую центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров с 45 миллилитровыми буферами для очистки и инкубируйте при температуре 45 градусов Цельсия с легким встряхиванием в течение семи дней. Меняйте буфер ежедневно в течение этого начального семидневного периода, выливая использованный буфер для очистки в контейнер для химических отходов.

И добавляем 45 миллилитров свежего буфера для очистки. После того, как все липиды растворятся и ткань достигнет прозрачности, переложите образец в новую центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров, заполненную 45 миллилитрами PBST, и промойте четыре раза при температуре 40 градусов Цельсия с легким встряхиванием в течение следующих 24 часов, чтобы удалить остатки SDS. После окончательной промывки PBST переложите образец в чистую центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров, заполненную одним микрограммом на миллилитр DAPI и 1xPBST.

Оберните фольгой и выдерживайте при комнатной температуре в течение 24 часов. На следующий день стирать три раза в PBST при комнатной температуре не менее шести часов за одну стирку. А затем приступаем к согласованию показателя преломления.

Чтобы начать эту часть процедуры, перенесите образец в чистую центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров, заполненную 2-2 тиодиэтанолом и 1xPBS при pH 7,5, и инкубируйте, как показано на экране. Ближе к концу второй инкубации создайте камеру визуализации, раскатав кусок многоразового клея в цилиндр с равномерным диаметром, чуть превышающим толщину образца. Выложите цилиндр по кругу с открытым концом на блюдо со стеклянным дном диаметром 40 миллиметров.

Затем с помощью наконечника для дозатора P1000 создайте уплотнение между многоразовым клеем и стеклом, прокатав его по внешнему краю цилиндра. Нанесите пипеткой примерно 100 микролитров 63% TDE на стеклянную чашку и распределите ее, чтобы покрыть поверхность стекла кругом многоразового клея. Затем с помощью шпателя аккуратно поместите образец в середину круга, стараясь не образовывать пузыри.

Затем нанесите пипеткой еще 100 микролитров 63% TDE непосредственно на образец и сразу же поместите круглое защитное стекло диаметром 40 мм поверх многоразового клея. Указательным, средним и безымянным пальцами обеих рук осторожно надавливайте по периметру круга до тех пор, пока покровное стекло не соприкоснется с образцом. Теперь медленно установите стеклянную нижнюю чашку в вертикальное положение, упираясь в поверхность, затем добавьте 63% TDE с помощью пипетки, пока раствор не достигнет небольшого отверстия в верхней части.

Используйте безворсовую салфетку, чтобы высушить наконечник пипетки, чтобы раствор не капал на стекло. Наконец, добавьте силиконовый эластомер в маленькое отверстие, чтобы закрыть круг и создать закрытую камеру. Подождите пять минут для высыхания, а затем приступайте к визуализации.

Поместите камеру визуализации с образцом внутри на предметный столик лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Откройте программное обеспечение для обработки изображений, чтобы включить лазер возбуждения аргона, перейдите на вкладку конфигурации в верхней части программы, затем на значок лазера. Установите флажок рядом с аргоном для питания лазера и переместите шкалу слайда на 30%Вернуться на вкладку получения вверху.

В окне настроек пути луча перейдите в окно настройки загрузки-сохранения и выберите выпадающее меню, чтобы выбрать подходящий канал длины волны для излучения YFP. В окне настроек канала выберите подходящие цели для визуализации, щелкнув красную гиперссылку с надписью «Текущий объект». Используйте объективы с рабочим расстоянием, превышающим толщину ткани.

А большая числовая апертура позволяет максимально увеличить разрешение изображения в плоскости и минимизировать толщину оптического сечения. В левом столбце выпадающих меню откройте окно разрешения XY, чтобы установить матрицу сбора данных, называемую форматом 1024x1024, или значение, соответствующее пределу бокового разрешения объекта. Установите коэффициент масштабирования как можно ниже.

Здесь используется версия 1.7. В этом же окне задайте параметры среднего значения восьмой строки и среднего значения по одному кадру, выпав вниз меню с соответствующими надписями. Найдите образец с помощью элементов управления рабочей областью.

Как только репрезентативное поле станет видимым, установите усиление в диапазоне от 760 до 780, а смещение в диапазоне от 1,0 до 1,5 для YFP. Выберите сканирование плитки. А затем установите верхний и нижний пределы стека Z, который будет получен.

Установите толщину оптического сечения на основе предельного разрешения оптического сечения объектива, а затем начните сбор данных. На этом изображении показаны YFP-положительные нейроны в коре головного мозга и гиппокампе, изображенные в 5-кратном увеличении и реконструированные в 3D. Масштабная линейка соответствует одному миллиметру.

Эта проекция максимальной интенсивности 10-кратного стека изображений коры головного мозга демонстрирует дендритную аборизацию пяти пирамидальных нейронов коркового слоя. Здесь масштабная линейка представляет собой 100 микрон. Здесь экспрессия THY-1YFP показана в интактном шейном и грудном отделах спинного мозга, визуализирована с 5-кратным увеличением и реконструирована в 3D.

Масштабная линейка представляет собой два миллиметра. Наконец, это проекция максимальной интенсивности 10-кратно изображенного стека спинного мозга, демонстрирует отдельные аксоны, масштабные линейки представляют 100 микрон. При правильном применении эта техника может быть выполнена за две-четыре недели для всего спинного мозга и от четырех до шести недель для полуразрушенного мозга.

После этой процедуры могут быть использованы другие методы, такие как иммунохимия, чтобы ответить на вопросы, требующие более сложного биохимического фенотипирования. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как оптически очистить и визуализировать центральную нервную систему мыши. С помощью пассивной прозрачности и лазерной конфокальной микроскопии.