Метод очистки тканей для визуализации нейронов от мезоскопических до микроскопических масштабов

Наш протокол облегчит исследование нейронных структур от схемы до компонентного масштаба, что важно для лучшего понимания функций мозга. Наша техника очистки, ScaleSF, обладает мощными возможностями очистки, а также высоким уровнем сохранности тканей, который необходим для одновременной визуализации как крупных, так и мелких структур. Наш протокол особенно эффективен в мозге, где нейронные клетки демонстрируют сложные процессы, огромные связи и организуют специализированные тонкие субклеточные структуры.

Перед началом эксперимента подготовьте растворы Sca/eS, как показано в этой таблице, и покройте образцы фольгой. Начните процедуру с добавления восьми миллилитров каждого из растворов ScaleS0 и ScaleS4 в две отдельные лунки пластины для культивирования шестилуночных клеток и предварительно разогрейте пластину до 37 градусов Цельсия в инкубаторе. Переложите ломтики мозга в предварительно нагретый раствор ScaleS0 шпателем и высиживайте ломтики в течение двух часов при 37 градусах Цельсия в встряхивающемся инкубаторе при 90 об/мин.

Затем перенесите пермеабилизированные срезы мозга в восемь миллилитров PBS минус в шестилуночную пластину для культивирования клеток и промыть в течение 15 минут, держа в орбитальном шейкере при 40-60 оборотах в минуту. Повторите этот шаг дважды. Затем переложите срезы мозга в восемь миллилитров предварительно разогретого раствора ScaleS4 и инкубируйте в течение восьми-12 часов при 90 об/мин при 37 градусах Цельсия.

Для подготовки камеры 3D-печать камерной рамы и адаптеров сцены микроскопа. Прикрепите раму камеры к крышке с помощью чувствительного к давлению клея. Готовят 1,5% агарозу в растворе ScaleS4D25(0)..

Перемешайте раствор и разогрейте его в микроволновой печи до полного растворения агарозы. Затем дайте раствору остыть до 37 градусов Цельсия. Установите очищенный мозговой срез на нижнюю крышку камеры визуализации шпателем.

Удалите лишний раствор с очищенного среза с помощью чистой ткани. Добавьте гель ScaleS4 в срез мозга с помощью микропипетки, чтобы заполнить камеру визуализации. Положите сверху еще одну крышку с щипцами, а затем лист папиросной бумаги и стеклянную горку.

Переместите камеру визуализации в холодильник при четырех градусах Цельсия. Поместите металлические гири на стеклянную горку и оставьте их на 30 минут. После инкубации извлеките материал из камеры визуализации и вытрите лишний гель.

Поместите камеру визуализации в 60-миллиметровую стеклянную чашку Петри и прикрепите ободок камеры визуализации в нескольких точках к чашке чувствительным к давлению клеем. Налейте раствор ScaleS4 в посуду и аккуратно встряхните в течение одного часа при 40-60 об/мин при температуре от 20 до 25 градусов Цельсия. Заменить свежим раствором и удалить пузырьки воздуха на поверхности геля, аккуратно соскоблив поверхность с помощью наконечника пипетки.

Установите камеру визуализации на ступень микроскопа. Подготовьте конфокальный лазерный сканирующий микроскоп, оснащенный объективом с несколькими погружениями с рабочим расстоянием 2,5 миллиметра, 16-кратным увеличением и числовой апертурой 0,60. Включите все необходимое оборудование для обработки изображений, такое как рабочая станция, микроскоп, сканер, лазеры, ртутная лампа, и запустите программное обеспечение для визуализации.

Установите корректирующий воротник объектива с несколькими погружениями на 1,47. Погрузите объектив в раствор и позвольте ему медленно приблизиться к срезу. Удалите все пузырьки воздуха, захваченные на кончике объектива.

Найдите области, представляющие интерес в очищенных тканях с помощью эпифлуоресценции. Чтобы задать параметры получения изображения, сначала определите битовую глубину для получения изображения по мере увеличения размера изображения с битом. Затем установите длину волны обнаружения в соответствии со спектром излучения.

Установите разрешение XY, скорость сканирования и размер точечного отверстия. Также отрегулируйте мощность лазера, усиление усилителя детектора и смещение до получения подходящего изображения. Определите размер плитки на основе размера ROI, гарантируя, что вся длина и ширина ROI фиксируются.

Перемещайтесь по ткани во всех плоскостях и устанавливайте начальную и конечную точки стека. Установите размер шага Z в соответствии с требуемым разрешением Z. Собирайте изображения и обрабатывайте их с помощью программного обеспечения для анализа изображений.

С помощью этого протокола была достигнута оптическая очистка среза мозга мыши толщиной в один миллиметр. Экспрессия EGFP в коре головного мозга мышей PV-FGL показала, что флуоресценция и структурная целостность тканей сохраняется. Несоответствие показателя преломления, вызванное аберрациями, вызвало заметную потерю яркости изображения и разрешения EGFP-положительных нейронов.

Эти нейроны были четко визуализированы с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа, когда коррекционный ошейник был скорректирован в соответствии с этим решением ScaleS4. 3D-реконструкция меченых EGFP нейронов в первичной соматосенсорной коре мыши была выполнена в срезе мозга толщиной в один миллиметр. Отдельные дендритные беседки, украшенные дендритными шипами, были замечены при более высоком увеличении.

В срезах также наблюдалась терминальная арборизация аксонов и аксональные бутоны. Соответствие отражающего индекса между жидкостью визуализации и линзой объекта имеет решающее значение для 3D-визуализации в очищенных тканях. Наша методика облегчит интеграцию структуры нейронов от схемы к компоненту, обеспечивая понимание нейронных механизмов, информацию об обработке в мозге.